实时荧光定量PCR实验结果分析.ppt

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1、实时荧光定量PCR实验结果分析邓椋爻技术支持广州市昊洋贸易有限公司定量分析绝对定量相对定量定量PCR应用定性分析SNP分析，基因扫描阴阳性判定熔解曲线分析绝对定量：HowMany–优点：给出目标基因初始模板的绝对数量，数据容易处理–缺点：必须有标准品，做标准曲线–应用：病毒拷贝数；转基因的拷贝数；转基因成分百分含量检测绝对定量与相对定量相对定量:HowMuch–优点：需要/不需要标准品；使用广泛–缺点：数据理解困难–应用：差异表达分析；芯片评估14500copies108106102104绝对定

2、量108106102104T绝对定量绝对定量108106102104T绝对定量105copies/well绝对定量1/3Blank1/31/31/31.11ng/2ul0.37ng/2ul0.12ng/2ul10.0ng/2ul3.33ng/2ul相对定量TControlCT=21.3SampleACT=22.8SampleBCT=19.3相对定量ControlCT=21.3=1.5ng/tube1SampleACT=22.8=0.5ng/tube0.33SampleBCT=19.3=6.0

3、ng/tube4Fold相对定量相对定量数据处理•管家基因校准(NormalizationGene)–得出每个细胞中的[目的基因]–目标基因vs.管家基因•对照样品校准(CalibratorSample)–得出相对于某个样品的基因表达量,1Xsample.–处理的vs.未处理的，6hrvs.0hr,病理vs.正常….目标基因管家基因处理后处理前ERBB2GAPDHSampleCalibrator按比例稀释标准品，根据标准曲线确定样本初始模板浓度至少需要两个标准曲线GOI≥referencege

4、ne标准曲线确定反应扩增效率相对定量——标准曲线相对定量相对定量：∆∆CT法依据：平均相对含量%=2–平均ΔΔCT数据处理：△C（t）GOI-△C（t）ref=△C（t）△C（t）sample-△C（t）calibrator=△△C（t）好处：不做标准曲线应用范围：扩增效率较高，目标基因和内标基因扩增效率一致并且相互独立扩增；不做标准曲线，高通量检测（芯片评估）；不要求很高的精度应用实例-基因表达分析利用TaqMan技术研究ERBB2在乳腺肿瘤组织标本中的表达差异实验设计流程RNA提取RT-qP

5、CR实验结果分析RNA定量反转录(RT)设计qPCR实验方法AurumTotalRNAkitiScriptcDNASynthesisKit材料和方法已知在50%的乳腺肿瘤样本中，ERBB2表达异常，因此可以作为一个检测标准选用GAPDH作为内标基因－FAM标记的ERBB2探针－VIC标记的GAPDH探针标准品（质粒）构造标准曲线多重PCR反应阴性对照－无RNA对照（空白）－无逆转录酶对照（监控基因组污染）RNA定性及定量分析Experion™RNAStdSensChip5-500ng/ml100

6、-6,000ntExperion™RNAHighSensChip0.1-5ng/ml100-6,000nt乳癌组织RNA正常乳腺组织RNA5hr.at90°CIntactIntact7hr.at90°CIntact7hr.degradationGAPDHgeneIntact5hr.degradation一步法＆两步法在不同的反应管中运行RT&PCR1.反转录反应加热灭活反转酶2.PCR反应2.PCR反应1.反转录反应25°C5min42°C30min85°C5min冷却至4°CiScriptcD

7、NASynthesisKit设计qPCR实验方法定性条件摸索荧光化学物质SYBRGREEN染料Taqman探针定量PCR条件优化单双通道相互验证Fam标记目标基因探针VIC标记看家基因探针动态温度梯度5-6oCBelow10oCAbovePCR优化-温度确定预设退火温度PCR优化-熔解曲线}RealannealingrangePCR优化-扩增曲线RT-qPCR实验95ºC,15min94ºC,15sec60ºC,1minplatereadgotostep3,39moretimes10ºC,for

8、everEnd目标基因：未知样品生成标准曲线：标准品梯度监控系统故障：阳性对照?监控污染：阴性对照/基因组对照?校准生物学误差：看家基因?降低其余误差：重复实验结果分析-绝对曲线Color2-VICdetectionforGAPDHColor1–FAMdetectionforERBB2结果分析-单双通道相互验证ERBB2单双通道相互验证的实验结果A.MultiplexReactionsHealthyRNACarcinoma28.4826.4228.6826.9828.7826.9828.65±0