实验七细胞固定与染色技术.ppt

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1、实验七细胞固定与染色技术我的邮箱bucmedu.@qq.com一、实验原理1.细胞固定的原理培养的细胞离开培养环境后会发生复杂的改变，失去正常的成分，结构被破坏，甚至坏死；而对细胞的观察和操作大多是不能直接在培养环境中进行的，所以要对细胞进行固定，从而最大程度的保持细胞生活时的状态。其主要原理就是用相应的固定液使细胞内的蛋白质变性、硬化，保持生活时原有的成分和结构。2.细胞染色的原理细胞与周围背景没有明显的明暗差，所以通常观察到的细胞都是透明的，细胞的内部构造和成分都隐藏在背景当中，借助物理或化学的方法对细胞进行染色能够增强观察对

2、象与背景的区别，帮助我们进行定性或定量观察。二、固定目的是将细胞的结构和化学物质双重地保存下来，固定细胞的方法有：1．物理固定：如血膜空气快速干燥、冷冻干燥或直接冷冻切片。2．化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂均能对细胞结构中的某些物质加以固定保存。不同化学试剂所保存的化学成分、对酶活性的影响、保存结构的细腻度均不相同。因此，要根据实验要求和组化反应，选择最佳的固定方法和固定剂。如显示多糖常用乙醇固定，而显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。1.碱性染料：为阳离子染料，能接受质子，染细胞核的染料。如亚甲蓝、天青。2.

3、酸性染料：为阴离子染料，能释放质子。主要有荧烷-氧杂蒽染料和偶氮染料两类，能结合细胞的碱性成分并染色，如血红蛋白、嗜酸性颗粒成分等。3.复合染料：同时具有阴、阳离子型的染料如瑞氏染料（一）、染料（天然染料和人工染料）：将生物组织细胞和病原体染色，在显微镜下观察结构。发色基团和助色基团使生物学染色剂产生颜色和被染组织亲合。细胞染色技术（二）、细胞染色原理：一般以它们的物理现象和/或化学现象为依据1.物理作用：毛细管现象、渗透、吸收、吸附作用等2.化学作用：a.染料的化学成分：助色基团的存在，碱性染料在溶媒中为阳离子型，易与组织和细胞

4、内带负电荷的酸性物质结合；而酸性染料在溶媒中为阴离子型，与带正电荷的碱性物质结合。b.蛋白质的化学性质：蛋白质中的氨基酸含有不同数量的氨基（-NH2）和羧基（-COOH），同时还有其他活性基团。在游离状态时，-NH2获得一个H+变成带正电的-NH3+，而-COOH失去一个H+变成带负电的-COO-。分别与不同染料结合。c.周围环境的酸碱度：如环境pH＜pI（pI为等电点），则蛋白质带正电，结合酸性染料；反之，pH＞pI，则结合碱性染料。（三）、细胞染色法的类型1.普通染色法：经物理和/或化学作用的吸附、结合2.荧光染色法：荧光染料

5、，荧光显微镜3.细胞活体染色法：活体染料如灿烂甲酚蓝等4.细胞化学染色法：用化学反应显示细胞内某种成分。细胞免疫化学染色法（应用单克隆抗体技术、酶标记技术）1．瑞氏染料酸性染料伊红（eosin,E-）碱性染料亚甲蓝（methyleneblue,M+；又名美蓝）组成复合染料。甲醇：溶解美蓝和伊红ME；固定细胞的形态；提高对染料的吸附作用。注意：pH值的影响细胞各种成分多属蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液pH而定。在偏酸时正电荷（H＋）增多，易与伊红结合，染色偏红。在偏碱时负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。染料贮

6、存时间愈久，染色效果愈好。染液贮存，必须加塞，以防止甲醇挥发和被氧化成甲酸。加入甘油,防止甲醇挥发，染色清晰。瑞氏染色法（二）、试剂1.Wright染液：瑞氏染粉0.1g,甲醇60.0ml甲醇：有强大的脱水力，可将细胞固定为一定形态，并使蛋白质沉淀为颗粒状、网状等结构，增加细胞与染料接触表面积，提高对染料的吸附作用，增强染色效果。2.磷酸盐缓冲液（PBS）：磷酸二氢钾（无水）0.3g，磷酸氢二钠（无水）0.2g,蒸馏水加到1000ml。配好后用磷酸盐溶液校正pH，塞紧瓶口备用。染色方法：a.用蜡笔在细胞周围划圈，平放于染色架上。b

7、.加瑞氏染液覆盖细胞，固定1min。c.滴加等量或稍多的缓冲液，混匀，染色5-10分钟。d.用清水冲洗，待干后镜检。染色流程：勿冲洗再加瑞氏染色Ⅱ液5-8滴后将Ⅰ液和Ⅱ液充分混允静置10分钟直接流水冲洗3-5分钟（切勿先到掉染液）涂片经水洗干燥后用油镜分类计数100个白细胞李四123固定干燥后加瑞氏染色Ⅰ液5-8滴覆盖整个血膜1分钟注意事项：a.细胞要干透后才能染色，否则染色时易脱落b.染色时间与染液浓度、室温及细胞多少有关，一般染液淡、染色时间长些效果好。c.染液不能过少，以防蒸发沉淀。d.冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲，防染

8、料沉着。冲洗时间也不能长。e.染色过淡，可复染。f.染色过深可用水冲洗或浸泡，还可用甲醇脱色细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态Ⅱa期细胞核的染色质