HPLC使用常见问题.ppt

《HPLC使用常见问题.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、HPLC使用时常见问题分析一、规范操作HPLC的环境设置HPLC的日常操作条件温度：10～30℃；相对湿度<80％；最好是恒温、恒湿，远离高电磁干扰、高振动设备，有良好的通风设施。3流动相的配制HPLC对流动相的基本要求不与固定相发生化学反应对样品有适宜的溶解度必须与检测器相适应。如用紫外检测器时，不能选用截止波长大于检测波长的溶剂避免卤素离子（不锈钢系统）粘度小的液体4溶剂的要求流动相所用溶剂必须为色谱级水为重蒸水或超纯水缓冲液的PH值范围一般为2-8（取决于所用柱子的性能）5HPLC用水可以通过以下几个方面来得到专门的纯水机或超纯水机

2、；去离子水重蒸；二次或三次重蒸水；市场上瓶装的纯净水或蒸馏水不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质越高放置时间越短。使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或盐缓冲液建议不超过两天。6流动相的配制按色谱条件，以一定比例混合流动相后，抽滤（0.45µm滤膜），超声脱气。7滤膜类型聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。8常用的脱气方法氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高

3、。加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。抽真空脱气法：易抽走有机相。超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min，此法效果最差。在线真空脱气法：Agilent1100LC真空脱机利用膜渗透技术，在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。9脱气除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡气泡对测定的影响：1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形3）检测器中的气泡产生基线波动10为什么溶剂和样品要过滤?溶剂和样品过滤非常重要，它会

4、对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。11色谱柱柱内体积和平衡时间单次样品运行时间=分析时间+色谱柱平衡时间色谱柱平衡时间=10倍柱内体积÷流速平衡时间：大于30min，且基线平稳。4.6x500.5mL5min4.6x300.3mL3min4.6x150.15mL1.5min4.6x1501.54mL15min色谱柱柱内平衡时间

5、尺寸体积流速(mm)(Vm)1.0mL/min色谱柱平衡12Agilent1100手动进样器（G1328A,G1328B)进样13Agilent1100手动进样器工作原理六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国Rheodyne公司的六通阀进样器最为通用，各大HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。14工作原理手柄位进样(Load)位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔排出；将手柄转动至进样(Inject)位置时，阀与液相流路接通，由泵输

6、送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液相分析柱进行分析。151）进样应使用液相色谱专用平头进样针2）进样时，进样针应插到底3）转动手柄时应尽快，不要停留在中途4）不使用时将针头留在进样器内5）样品溶液pH小于10,常用密封垫的材质适用pH<10,否则换特氟隆材质的密封垫pH10-136）分析结束后冲洗进样口，清洗应使用专用针口清洗器定子转子塑料箍弹簧不锈钢套手动进样器操作注意点：167）手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。8）在

7、HPLC系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平头注射器。一方面，针头外侧紧贴进样器密封管内侧，密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面，也防止了针头刺坏密封组件及定子。手动进样时应注意，针中不能有气泡，在Load状态进样时推针要慢，由Load切换到inject时动作要迅速，停留半分钟后取针，进样后应洗针。179）六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。使用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的75％，如20μl的定量环最多进样15μl的样品，并且要求每次进样体积准确、相同；使用完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的

8、3至5倍，即20μl的定量环最少进样60至100μl的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。推荐采用100ul的平头进样针配合20ul满环进样。1810）进