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1、樟树籽蛋白质的提取与分析08生物林开鹏指导老师：李卫林目录前言材料与方法结果与讨论结论前言1樟树籽简介1）外形樟树籽,又名樟梨、香樟大木姜子、樟子等。成熟的樟树籽呈扁球形,直径大约5～9mm,每千粒重大约是200g,果皮肉质薄,能散发出芬芳的清香2）药理作用樟树籽有驱风散寒、行气止痛之功效。癸酸(C10)已应用于医药行业合成鱼腥草素等消炎药,主要含有癸酸(C10)的樟树籽脂肪油已被试制成碳酸甘油脂,用于治疗脂肪代谢紊乱病症,并能降血脂及胆固醇。材料与方法材料樟树籽干燥70摄氏度24小时，备用试剂石油醚（
2、C.P.，沸程30～60℃），磷酸氢二钠（分析纯AR），磷酸二氢钠（分析纯AR），氯化钠（分析纯AR），95%乙醇（分析纯AR），Tris（分析纯AR），浓盐酸（分析纯AR），SDS（分析纯AR），甘油（分析纯AR），溴酚蓝（分析纯AR），-丙烯酰胺（分析纯AR），巯基乙醇（分析纯AR），甲醇（分析纯AR），考马斯亮蓝R-250（分析纯AR），冰醋酸（分析纯AR）器材FZ102型植物粉碎机，索氏提取器，离心机，紫外分光光度计，垂直电泳槽，电泳仪，微型凝胶电泳装置（厂家）；水浴锅；Eppendorf管；微
3、量注射器（50μl或100μl）。实验提取方法1）称样取10g样品装入滤纸斗中，把滤纸斗的开口处折起来封死；防止样品泄出滤纸斗。调整滤纸斗的高度，使其放在抽提管中时略低于虹吸管的上弯头处2）虹吸向提取管中倒入石油醚，使其液面达到第一次液面的一半，冷凝管与自来水管相连轻轻打开自来水（冷凝用），将索氏提取仪整个装置放入恒温水浴锅中加热提取（水温80℃左右）提取时间2～2h，约虹吸10次以上3）回收取下平底烧瓶，将提取管的下端口插入回收瓶中，倾斜装置，提取管中的石油醚会虹吸而流入回收瓶中，达到回收的目的。再装
4、上平底烧瓶，继续放入恒温水浴锅中加热直至冷凝管下端无石油醚滴下，表明平底烧瓶中的石油醚已经蒸干。注意：必须蒸干后才能放入干燥箱烘干，否则会引起火灾。取下平底烧瓶，回收提取管中的石油醚4）称量粗脂质量将平底烧瓶放入120℃的电热鼓风干燥箱中烘15min，取出冷却后称重（须戴手套，以免烫伤）。再将平底烧瓶用洗涤剂洗净，于120℃的电热鼓风干燥箱中烘干（约15min），取出冷却后称重，两者的质量之差就是粗脂的质量。5）蛋白质的溶解将上述去脂烘干的样品置于烧杯中，加入ph为7.2的磷酸盐缓冲夜100ml浸提2h
5、蛋白质的分离方法1将浸提液均匀倒入两个离心管使两管质量相同，对称放入离心机中，调整离心机4000转5分钟，将上清液倾入烧杯，加晶体NaCl少许（加速沉淀并使沉淀完全），待溶解后再加入95%的乙醇100ml混匀。观察有无沉淀析出2将所得溶液离心，获得沉淀，用1%NaCl溶液溶解定容于250ml容量瓶中，备用。蛋白质的定性1茚三酮反应取1支试管加入蛋白质溶液1毫升，再加0.5毫升0.1％茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1—2分钟，观察颜色在一小块滤纸上滴一滴0.5％的甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴上一滴0
6、.1％的茚三酮乙醇溶液在微火旁烘干显色，观察2黄色反应取一试管，置所提取的蛋白质溶液10滴及浓硝酸3~4滴，加热，冷却后再10%NaOH溶液5滴，观察颜色变化,蛋白质的等电点实验步骤：取同样规格的试营4支,向以上试管中各加样品蛋白的醋酸钠溶液1毫升,加一管,摇句一管.此时1,2,3,4管的pH值依次为1,3,5,7观察其混浊度.静置10分钟后,再观察其混浊度.最混浊的一管的pH即为样品蛋白的等电点.紫外光吸收法测定蛋白质浓度在紫外分光光度计上，将未知的蛋白质溶液小心盛于石英比色皿中，以生理盐水为对照，测
7、得280nm和260nm两种波长的吸光度（A280nm及A260nm）。将A280nm及A260nm波长处测得的吸光度按下列公式计算蛋白质浓度。C=1.45A280nm－0.74A260nm式中C：蛋白质质量浓度（mg/ml）；A280nm：蛋白质溶液在280nm处测得的吸光度；A260nm：蛋白质溶液在260nm处测得的吸光SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法—蛋白质的分子量测定实验试剂配制灌制分离胶电泳制备样品和上样.灌制浓缩胶考马斯亮蓝染色结果与讨论前处理粉碎后用烘箱对樟树籽进行干燥时，粉末热时湿度较大冷时
8、结冻成固态，可以体现樟树籽中油脂含量较高，称量樟树籽10.002g索氏抽提得到蛋白和淀粉的混合物重7.623g，计算油脂的含量粗脂的含量（%）=2.377／10.002*100%=23.765%蛋白质的提取乙醇沉淀蛋白法等本实验采用了乙醇沉淀蛋白,其优点是避免蛋白质变性,尽可能减少杂质。本实验采用磷酸盐缓冲液溶解蛋白质再用乙醇为脱水剂破坏蛋白质胶体质点的水化层，使其沉淀析出进而对樟树籽蛋白进行提取，提取效果好，提取率蛋白质的颜色反应是检验蛋
