分子生物学常用技术及其应用.ppt

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1、分子生物学常用技术及其应用主要内容基因工程重组DNA技术-基因工程核酸分子杂交技术PCR技术基因诊断与基因治疗第一节基因工程基因工程的基本概念工具酶载体重组DNA技术的基本原理重组DNA技术的基本过程基因工程在医学中的应用一、基因工程的基本概念DNA重组：不同来源的DNA分子可以通过末端共价连接而形成重新组合的DNA分子的过程。基因工程：将基因进行克隆，并利用克隆的基因表达、制备特定的蛋白或多肽产物，或定向改造细胞乃至生物个体的特性所用的方法及相关的工作。二、工具酶限制性核酸内切酶其它工具酶1、DNA连接酶2、DNA

2、聚合酶3、逆转录酶4、多核苷酸激酶5、碱性磷酸酶6、末端脱氧核苷酸转移酶三、载体质粒噬菌体粘粒病毒四、重组DNA技术的基本原理五、重组DNA技术的基本过程目的基因的制备方法：1、基因组DNA文库2、制备cDNA文库3、PCR4、化学合成目的基因与载体的连接方法：1、粘性末端连接2、同聚物加尾连接3、平末端连接4、人工接头连接将外源DNA导入宿主细胞方法：1、转化2、感染目的基因的筛选和鉴定方法：1、遗传学方法2、分子杂交法3、免疫学方法克隆基因的表达六、基因工程在医学中的应用医学基础的研究疾病的诊断和基因治疗基因工程药

3、物转基因动物人类基因组计划蛋白质工程第二节重组DNA技术-基因工程重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一。即是基因工程(GeneEngineering)的核心技术。重组DNA技术（RecombinantDNATechnique）是人类根据需要选择目的基因（DNA片段）在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的发现和应用。一、限制酶限制性内切核酸酶(restrictiveendonucleases)，又称限制酶。是

4、特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手术刀”）。发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。1、限制酶的命名根据其来源命名。如：属名菌株名EcoRI种名编号EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制酶。2、限制酶识别序列和切割形成每种限制酶能识别和切割的通常4～8个核苷酸序列，称为限制性位点或切点。如：HareⅢ5’-GGCC-3’BamHI5’-GGATCC-3`平末端(bluntend)对

5、称轴切，连接效果差切割形成粘性末端（stickyend）交错切。部分常用限制酶及切点互补末端连接产生相同序列的突出末端的不同片段可有三种方式：1)用同一种限制酶切割；2)用识别相同靶序列的不同限制酶切割；3)用识别不同靶序列但可产生一致的粘性末端的限制酶切割。3、特点：根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断中的重要用途：1)不论DNA的来源如何，同一种限制酶切割后产生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属的DNA重组。如人和质粒DNA等。2)用于人类基因组的DNA分析，具特定的酶切位点。3)Gene突变改变酶切

6、位点的消失或新产生将改变酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。二、基因运载体及其选择载体（Vector）:将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。载体具以下特征：1)分子量小，便于携带较大的DNA片段，能进入宿主细胞并在其中增殖；2)有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一切点；3)被切割后的载体，插入外源DNA后，不影响其复制能力，并有可选择的标记基因（如，抗药基因）。常用的载体有：质粒，λ噬菌体，粘粒，BAC，YAC，PI等。（一）.质粒plasmidPlasmid独立于细菌染色体外的双链环DN

7、A分子。PBR322大肠杆菌pSC101PlasmidchromosomeCOIEIplasmid革兰氏阴性菌pc194scp12真核生物-酵母质粒常用的质粒如pUC19，多连接子MCS。插入外源基因片段长度约10kb。将外源基因插入到MCS中，随质粒的表达而表达，增殖而扩增。外源基因插入到MCS后，β-半乳糖苷酶的活性丧失而不显兰色-白色菌落。如果不插入外源基因，则产生兰色。从而筛选阳性菌落。EcoRIHindIIIOri复制起点LacZAPRpUC19（二）.λ-噬菌体(λphage)是一种可在体外包装的细菌病毒,

8、可高效感染大肠杆菌.λ-噬菌体DNA是线状双链DNA分子,全长约50kb,每条链各带12bp长的单链互补末端-粘末端(COS序列)。进入宿主细胞后不久，COS序列碱基配对环化。改建后的λ噬菌体发展了多种较大型的克隆载体，如：1、置换λ载体–溶解途径载体和外源DNA整合到宿主菌DNA中。可克隆23kb的外源DNA。2、插入λ载体–裂