单克隆抗体的制备、纯化及鉴定.doc

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1、单克隆抗体的制备、纯化及鉴定一、实验FI的：单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方而内容。了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。二、实验原理：骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特杲性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经在HAT培养基［含有次黄嚓吟(H

2、)、氨基喋吟(A)和胸腺U密噪核昔(T)］屮进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在休外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基屮的氨基蝶吟阻断，又因缺乏次黄瞟吟■鸟瞟吟・磷酸核糖转移酶(HGPRT),不能利用培养基屮的次黄瞟吟完成DNA的合成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嚓吟■鸟嚓吟■磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基屮存活和增殖。经过克隆选择，可筛选出能产生特杲性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在休内或休外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。三、试剂与器材：细胞培养板、

3、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜等。四、操作方法：1、抗原制备；一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。A.可溶性抗原(蛋白质)以1mg/ml〜5mg/ml的溶液加等量的弗氏完全彳左剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml〜0.6ml,间隔3〜5周再同样注射一次，10天后，断尾取血一滴，测抗休效价，选滴度高的小鼠做融合试验。一个刀后可以经静脉(尾静脉)给予龙佐齐I」抗原0.2ml〜0.4ml,3〜4天后，杀死小鼠取脾做融合用。B.颗粒性抗原如抗原來源方便，可

4、以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔吋间。例如用羊红血球免疫小白鼠，以1%浓度每只皮下注射0.2ml,每周2次，共免疫5〜8次，取脾前3天，再免疫一次即可。有人认为最后一次免疫剂量要大，大到近于免疫耐受的程度更好。2、免疫动物；丨I前应用最广的是小白鼠和人白鼠，尤以小白鼠为好。就詁系而言以Balb/c小白鼠应用最广，因为所有的小白鼠骨髓瘤系均从Balb/c小白鼠系诱导出来。Balb/c系小白鼠必须用纯系的，雌雄均可，以8〜12周龄为宜。大白鼠也可，能产生较多量的单克隆抗体。现在已经在小鼠杂交瘤的基础上,发展了小鼠一

5、大鼠，小鼠一人以及人一人杂交瘤技术。免疫程序、剂量和方法是关系到是否能得到所需要的单克隆抗体的关键之O正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗休的B淋巴细胞，一只纯种小白鼠估计能产生1.0X107〜5.0X107种不同的抗体。因此一只正常的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合，只能有千万分Z—的机会获得某一种特定抗体。所以为了提高得到某种杂交瘤的机会，必须加强免疫，使产生特异性抗体的B淋巴细胞大量增加。B淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很大影响。有人认为处在转化时期的B淋巴细胞可能更易于融合，而免疫以后7~8天，虽然

6、是抗体产生的高峰时期，但形成有活力的杂交瘤细胞的可能反而减少。故-•般认为加强免疫后的第三天应杀鼠取脾做细胞融合。3、免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；脾细胞制备(1)免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠，拉颈或用CO?处死小口鼠。(2)将小鼠放于7()%酒精屮浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。⑶把脾放入5ml含有2.5%FCS的1640液屮，冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。(4)用锡子轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管屮。(5)直立小试管3min,使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管

7、小。(6)以2.5%FCS—1640充满离心管，并以400g离心7min〜lOmin(与此同时应开始制备骨髓细胞)。(7)把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮。(8)重复⑹、⑺步骤。(9)计算细胞，以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高于80%为合格。骨髓瘤细胞制备骨髓瘤细胞能产牛并分泌大量的免疫球蛋白，这样的瘤细胞融合后，可能影响或降低所分泌抗体的滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。选择骨髓瘤细胞的条件：①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致；②骨髓

8、瘤细胞必须是静息状态，不产生y球蛋白或不分泌到细胞外；③骨髓瘤细胞牛长需要一个较高的细胞密度，最好106个细胞/ml；④生长速度快，繁殖吋间短。H前常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：①S194/5XXO-BU-1；②SP2/0—Agl4(简称SP2)；③P2—X?—Ag8•6•5•3(简称653)；④FO以653最为常用，它是由矿物油4一甲基一15烷(Prist