抵抗素对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响【大学临床医学毕业论文设计，精选】.doc

《抵抗素对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响【大学临床医学毕业论文设计，精选】.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、临床医学论文■抵抗素对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响作者：李芳萍，李袋，傅玉如，严励，傅祖植【摘要］【日的】构建载有小鼠抵抗索(resistin)基因及其反义核酸的重组真核表达质粒'探讨抵抗素对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响。【方法】用RT-PCR技术从小鼠脂肪组织扩增抵抗素基因cDNA，A/T克隆于pGEM-T载体，再亚克隆于pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(・)真核表达载体，构建载有小鼠抵抗素(resistin)基因及其反义核酸的重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)・res

2、istin和pcDNA3.1(-)-resistin(-)。将pcDNA3.1(-)-resistin(-)转染小鼠3T3-L1脂肪细胞通过G418筛选稳定表达的细胞株。3丁3丄1脂肪细胞分为对照、瞬时、载体和稳定4个细胞组(每组】匸6)‘用3H・2■脫氧葡萄糖进行非胰岛素和胰岛素介导的葡萄糖摄取试验。【结果】插入pcDNA3・1(+)的DNA片段的核苗酸序列与小鼠抵抗素基因mRNA编码区序列完全一致‘且方向正确；插入PCDNA3.1(-)的DNA片段的核莒酸序列勻抵抗索基因mRNA编码区核苜酸序列

3、完全一致'且方向相反。对照组、瞬时组、载体组和稳定组的3T3-L1脂肪细胞非胰岛素和胰岛素介导的葡萄糖摄取率的无显著性差别(P>0.05)。【结论】成功构建了载有抵抗素基因和载有抵抗素基因反义核酸的重组真核表达质粒。抵抗素对3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取均无明显影响。【关键词】抵抗索；脂肪细胞；葡萄糖摄取抵抗素(rcsistin)是2001年发现的存在于血浆中富含半胱氨酸的分泌性蛋白质。在啮齿类动物其主要由脂肪细胞特异性分泌，可损害机体的糖耐量，影响组织对胰岛素的敏感性［1］，被认为是一种将肥胖与

4、2型糖尿病联系起來的重要信号分子［2］。已明确抵抗素基因及蛋白质的分子结构，抵抗素基因表迖受胰岛素［3］、肿瘤坏死因子a［4］等多种因索调控，抵抗索可能勻肥胖、胰岛索抵抗及2型糖呆病的关系密切［5］，可能直接影响血管内皮细胞功能，参与动脉粥样硬化的形成［6,7］。为开展抵抗素生物功能硏究，我们拟构建载有小鼠抵抗素基因及其反义核酸的真核表达质粒。抵抗素基因反义核酸的真核表达质粒转染3T3-L1脂肪细胞，试图让抵抗素基因反义核酸抑制3T3-L1脂肪细胞抵抗素基因的表达，观察抵抗索对脂肪细胞葡萄糖摄取的影

5、响。1材料与方法1・1主要试剂pGEM-TVectorsystemI（Promega公司）,pcDNA3.1（+）和pcDNA3.1（-）真核表达质粒（Invitrogen公司）。3T3-L1前体脂肪细胞（由北京医院老年硏究所细胞室提供）?SuperFectTransfectionReagent（QIAGEN公司）,G418（购自GIBC0BRL公司）Complete,Mini复方蛋白酶抑制药片（Roche公司）3•异丁基1■甲基黄»（Sigma公司），短效胰岛素（HumulinR，美国礼来公司），

6、地塞米松（中国浙江医药股份有限公司），豚鼠抗小鼠抵抗素抗体（_抗Guineapiganti-mouseresistin»Linco公司），辣根过氧化物酶结合的抗豚鼠IgG（H+L）（晶美公司），细胞松弛索B（Sigma公司）3H-2-脫氧葡萄糖（放射性比活度200GBq/mmol，中国同位素总公司）。1.2方法1.2.1引物设计根扌居文献报道的小鼠抵抗素基因mRNA序列（基因库的登录号为AF323080），用计算机软件设计扩增抵抗素基因mRNA编码区序列的特异引物'上游引物：5'・CGGAATTCA

7、TGAAGAACCTTTCATTTCC-3'（下划线的部分为EcoRI酶切位点），下游引物：5'・CTAGTCTAGATCAGGAAGCGACCTGCAGCT-3"（下划线的部分为XbaI酶切位点）。上、下游弓I物的5'端分别引入EcoRI和XbaI酶切位点，以便扩增的目的cDNA插入载体，扩增片段理论长度为363bp。1.2.1抽提总RNA取16周龄正常雄性BALB/C小鼠附睾周围及网膜的脂肪组织，置于TRIzol中，用电动匀浆器磨碎成匀浆，按TRIzolReagent操作说明抽捉小鼠脂肪组织总R

8、NA。凝胶电泳鉴定总RNA的质量，紫外分光光度法检测总RNA纯度和浓度。1.2.2RT-PCR合成抵抗素cDNA0.5/zg//zL总RNA2“L、l0倍逆转录反应缓冲液2“L、10mmol/LdNTPMix2“L、50mmol/LMgC122“L、17pmol//zL序列特异性下游引物1.5”L、50U/“LRNA酶抑制剂1”L、20U/HLAMV逆转录酶1“L，加DEPC处理的水使反应体积达20“L，42°C孵育1h进行逆转录反应，99°C5min使酶失活。在一个