黄河鲤Wnt4基因的克隆、表达模式分析和Wnt信号通路基因的结构及功能分析.pdf

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1、CLONING,EXPRESSIONANDFUNCTIONANALYSISOFWNT4ANDSTRUCTURE,FUNCTIONANALYSISOFGENESINWNTSIGNALINGPATHWAYINYELLOWRIVERCARPADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanNormaluniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByJiXiaolinSupervisor:Pr

2、of.DuQiyanMay,2016摘要Wnt4(wingless-typeMMTVintergrationsitefamily,member4)是Wnt基因家族成员之一，从无脊椎动物到哺乳动物广泛存在，参与多种生命活动，并且在哺乳动物中已经证实其在卵巢分化过程中有重要作用。本研究根据已经得到的其它硬骨鱼类的Wnt4基因序列保守区设计引物，结合RACE技术，得到了黄河鲤该基因的全长序列。结果表明，得到的序列中5'非翻译区（5′-UTR）445bp，3'非翻译区（3′-UTR）包含polyA尾共988bp，开放阅读框1056bp，编码35

3、2个氨基酸，预测分子量为39409.2道尔顿，理论等电点为8.61，共编码20种氨基酸，带有负电荷氨基残基（天冬氨酸和谷氨酸）39个，带有正电荷氨基残基（精氨酸和赖氨酸）48个，有24个半胱氨酸残基为Wnt基因家族所特有，有22个氨基酸的信号肽序列，有跨膜区，为分泌型蛋白。对黄河鲤WNT4蛋白的二级结构进行预测，发现α螺旋占比30.11%，β转角占比9.94%，无规卷曲占比40.34%，延伸链占比19.6%。氨基酸序列在硬骨鱼类中保守性较高，而与两栖类、鸟类、哺乳类动物间保守性较低。黄河鲤与同为鲤形目的模式生物斑马鱼该基因间的相似性达到

4、98.3%，在进化上最接近。本研究用RT-PCR、qRT-PCR和原位杂交三种方法对该基因在胚胎发育时期、6月龄雌雄组织和成熟个体雌雄组织中的表达进行研究，相互进行验证，最终三种方法结果一致。在胚胎发育时期都可以检测到Wnt4基因的表达，总体呈现先上升后下降平稳表达的趋势，整体原位杂交结果显示从原肠胚时期的内胚层到孵化后的肝脏部位均有明显阳性信号，在6月龄和成熟个体组织表达研究中也发现该基因在肝脏中表达量较高，同样的结果在一些低等动物中有证实，推测其可能对黄河鲤肝脏的发育和功能维持有重要作用。在卵巢中，黄河鲤Wnt4基因在成熟卵巢中的表

5、达要高于Ⅱ期发育中的卵巢，主要表达在卵母细胞的细胞质中，与已有研究相似，推测黄河鲤Wnt4基因参与卵巢的发育和功能维持，并不参与早期的卵巢分化。在精巢中，可以看到黄河鲤成熟期精巢中Wnt4基因的表达量高于二期精巢，同时高于成熟期卵巢，该结果发现在精巢中的表达模式与多数哺乳动物相比并不保守，但与一些硬骨鱼类表达模式相似，推测其成熟雄性性腺中Wnt4基因的高表达可能是参与了雄性类固醇生成的延迟。综上，该基因参与两I性性腺的发育，并且在发育后期有重要作用。经典Wnt信号通路对于哺乳动物的性别决定和性别分化的作用已经研究较为透彻，本研究利用化学

6、抑制剂IWR-1-endo处理未分化的黄河鲤个体，希望对该通路对黄河鲤性别决定和分化的作用得到一些验证。结果显示，通过药物抑制，在实验组中通路下游转录因子以及6个雌性标志基因都出现了不同程度的表达量下调，而对于4个雄性标志基因的检测结果并没有统一性。综上，我们在对经典Wnt信号通路进行抑制后，发现了雌性基因的表达量均显著下调，推测其对于黄河鲤雌性性别发育有一定的作用，而其作用机制和对雄性性别发育的作用还有待进一步研究。关键词:黄河鲤，Wnt4，RACE，RT-PCR，原位杂交，Wnt信号通路IIABSTRACTWnt4(wingless

7、-typeMMTVintegrationsitefamily,member4)belongedtotheWntfamily,itwasfoundinbothinvertebratesandvertebrates,andinvolvedinmanyimportantprocesses.IthasbeenprovedthatWnt4genewasplayamajorroleinovariandifferentialinmammals.Inthisstudy,usingtheforwardandbackwardprimersdesignedo

8、nthebasisoftheconservedregionaminoacidsequenceoftheWnt4genesregisteredinGenbank.Weobtainedthefulllength