细胞实验的基本操作.docx

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1、细胞实验的基本操作【细胞培养】一、细胞的复苏：非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏。细胞复苏的原则——快速融化：必须将冻存在－196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。具体操作如下：1、实验前准备：1.1、将水浴锅预热至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。1.2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。2、取出冻存管及迅速解冻：2.1、根据细胞冻存记

2、录按标签找到所需细胞的编号。2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，1000～1500rpm离心3分钟；4、制备细胞悬液吸去上清液，加入10ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；5、细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内

3、培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定。通常，除少数特别注明对DMSO敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有10-15ml（5－10倍）新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。二、细胞的传代：培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。1、贴壁细胞的传代具体操作如下：1.1、

4、传代前准备：1.1.1、预热培养用液：把装有培养液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。1.1.2、用75％酒精擦拭双手和经过紫外线照射的超净工作台1.1.3、正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。1.1.4、点燃酒精灯：注意火焰不能太小。1.1.5、准备好将要使用的已灭菌的空培养瓶。1.1.6、取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。1.1.7、从培养箱内取出细胞，注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞，并做好记录。1.1.8、细胞培养瓶经用75％酒精擦拭后，再

5、放入超净台。1.2、胰蛋白酶消化：1.2.1、将瓶盖过酒精灯火焰消毒后，打开瓶盖，靠近酒精灯，小心吸出旧培养液，用PBS清洗2－3次，沿壁（无细胞的一面）缓缓加入适量消化液（胰蛋白酶液），轻轻摇晃。注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。1.2.2、显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。1.3、吹打分散细胞：1.3.1、弃去大部分消化液（仅留少量在瓶内），并轻轻拍打培养瓶，使细胞分散，然后加入新鲜的培养液，再用吸管轻轻吹打成细胞悬液（尽可能不要出现泡沫，否则对细胞有损伤〕1.4、分装

6、稀释细胞1.4.1、将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。1.4.2、倒置显微镜下观察细胞量，必要时计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后在瓶上做好标记，如细胞代数、日期及姓名等。1.5、继续培养：1.5.1、用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时为一个＋，占50％为＋＋，占75％时为＋＋＋。2、悬浮细胞的传代悬浮细胞可以直接将培养瓶中的液体吸掉，只留下少量，然后加入新鲜培养液即可。当细

7、胞悬液中碎片或颗粒物较多，感觉到比较脏时，可以将悬液移到离心管内，1000～1500rpm离心3分钟，弃上清，加入约2ml培养液，吹打至均匀，滴加2-3滴至已加入新鲜培养液的培养瓶中。然后置于二氧化碳培养箱中培养（拧松培养瓶盖）。三、细胞的冻存细胞冻存的原则是要逐步缓慢降温，以避免细胞内部形成冰晶对细胞造成伤害。1、具体操作如下：1.1、从增值期到形成致密单层以前的细胞都可以用于冻存，但最好选择对数增长期细胞，已长满的细胞冻存复苏后生存率低。在冻存前一天最好换一次培养液。1.2、贴壁细胞经消化、离心（1000～1500rpm，5min）收集，悬浮细胞经离心

8、收集；1.3、大约106个细胞加入1ml冻存液（10％DMSO+9