基因工程实验_biochemlab.ppt

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1、基因工程实验生物化学资料网实验目录实验一实验计划表实验二染色体DNA的提取实验三PCR扩增实验四凝胶电泳法回收目的DNA及其体外连接实验五感受态细胞的制备实验六重组质粒的转化实验七质粒的提取实验八重组质粒的酶切鉴定实验一实验计划表一、实验目的１、了解本学期整体的实验流程及安排。２、熟练使用微量移液器。３、学习制备琼脂糖凝胶。生物化学资料网基因工程（GeneEngineering）又称ＤＮＡ重组技术，把不同生物的ＤＮＡ与载体相连，并导入到受体细胞中去增殖、表达。基因工程包括切、接、转、增、检五大要素。二、实验原理生物化学资料网凝胶电泳系统、微量移

2、液器、三角瓶、微波炉、铲子、手套琼脂糖、1×TBE、加样缓冲液三、实验用具及试剂⑴目的基因的获取基因组总ＤＮＡ提取　　凝胶电泳检测ＰＣＲ扩增目的基因　　ＰＣＲ产物的电泳检测ＰＣＲ产物纯化　　　获得目的基因ＭＨＣ四、实验操作1.本学期实验计划生物化学资料网⑵ＤＮＡ重组、转化ＭＨＣ与pMD18-T连接　　DH5a感受态细胞制备转化、平板涂布、培养⑶筛选与鉴定抗生素抗性筛选　　挑单菌落培养　　提取质粒　　质粒酶切、电泳检测2.微量移液器的使用将微量移液器按钮轻轻压在第一挡垂直握持微量移液器，使吸头浸入页面下几毫米，千万别将吸头直接插到液体底部缓慢、平

3、稳地松开控制按钮，吸上样品液。否则液体进入吸头太快，导致液体倒吸入移液枪内部，或吸入体积减少。等1s后将吸头提高液面，并使吸头在容器壁擦过平稳把按钮压到第一停点，在把按钮压到第二停点以排出剩余液体、提起微量移液器，使吸头在容器壁擦过然后按吸头弹射器除去吸头⑴使用操作生物化学资料网⑵使用注意事项未装吸头的微量移液器绝对不可用来吸取任何液体。一定要再允许范围内设定容量，千万不要将读数的调节超出其适用的刻度范围，否则会造成损坏。不要横放带有残留液体吸头的移液器不要用大量程的移液器移取小体积样品微量移液器每日用完后，应旋转到最大刻度，让弹簧恢复原形，保

4、持弹性。为了确保微量移液器的准确性，移液器必须定期进行校准。生物化学资料网3.琼脂糖凝胶制作选择好胶盒、胶板和梳子，洗净，把胶板放入胶盒中，梳子插上。量取25ml1×TBE溶液放入锥形瓶或烧杯中称量0.25g琼脂糖，倒入锥形瓶中将锥形瓶放入微波炉中，让溶液沸腾2-3次，琼脂糖彻底融化锥形瓶取出，稍稍冷却后倒入胶盒中等待琼脂糖冷却凝固形成点样孔后即可掌握酚氯仿法提取ＤＮＡ的原理和操作。一、实验目的实验二　基因组总ＤＮＡ提取生物的大部分或几乎全部ＤＮＡ都集中在细胞核或类核中。DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对DNA制品的污染常影响到以后的DN

5、A操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。经苯酚、氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。DNA制品中少量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的RNase去除RNA污染。二、实验原理消化缓冲液:TE 、EDTA、NaCl、SDS、蛋白酶KTris平衡酚、氯仿:异戊醇(24:1)，NaAc，无水乙醇，70%乙醇三、实验用具与试剂微量移液器、高速离心机、1.5mlＥＰ管、吸头、烘箱、水浴锅、1.

6、5ml管架、胶头滴管、冰箱１、切取组织，剪碎放入研钵(越细越好)，磨成粉末。以消化缓冲液处理55℃水浴过夜，获得组织消化液。２、取出消化组织液，5000rpm ，３min，取上清液于新离心管。３、加等体积Ｔris-平衡酚，轻轻混匀５min。4、1000rpm，10min，留上清，取上清液于新离心管。５、加等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，轻轻混匀５min。６、同４。７、加等体积氯仿:异戊醇，轻轻混匀５min。８、同４。四、实验步骤９、加 1/10 体积3mol/L NaAc，及２.５ 倍体积预冷（－２０℃）无水乙醇，混匀。－２０℃沉

7、淀３０min。１０、12000rpm，15min，弃上清。１１、加70%乙醇1ml，混匀。１２、同１０。１３、ＥＰ管放置于烘箱中烘干。１４、加３０ulTE或ddH2O溶解ＤＮＡ。１５、琼脂糖凝胶电泳检测。提取染色体ＤＮＡ的基本原理是什么？操作中应该注意什么？五、思考题１、学习ＰＣＲ扩增的基本原理。２、掌握ＰＣＲ技术的常规操作。３、了解ＰＣＲ扩增的参数设计。一、实验目的实验三ＰＣＲ扩增１、聚合酶链反应(Polymerasechainreaction，PCR)：利用核酸变、复性的性质，以待扩增的ＤＮＡ为模板，在体外由引物介导的酶促合成特异ＤＮＡ片段

8、的过程。２、ＰＣＲ反应体系引物、dNTP、Mg２＋、模板、TaqDNA聚合酶，Buffer。二、实验原理３、ＰＣＲ循环参数①9５℃5min②9５℃30