生物技术专业大实验实验指导.doc

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1、《生物技术专业大实验》课程课程编号：0741524966实验指导书主撰人韩军丽王雪青金玉莲赵培审核人王素英天津商业大学生物技术与食品科学学院二零零九年十一月1.实验总体目标使学生掌握基因工程、分了生物学、细胞生物学及细胞T程实验技术，提高学生实验动手能力、以及在实验屮分析问题和解决问题的能力，为今后从事生物技术相关工作和研究打下坚实的基础。2.适用专业年级生物技术专业第6学期3・先彳I參课程生物化学、微生物学、遗传学、细胞与分了生物学、基因工程、细胞工程4.实验课时分配实验项目实验要求实验类型每组人数实验学时实验一目的基因的PCR扩增必做综合24实验二DNA片段的冋

2、收必做综合24实验三DNA的连接必做综合22实验四大肠杆菌感受态细胞的制备必做综合23实验五重纟RDNA的转化必做综合23实验六快速分离大肠杆菌屮的重纽.质粒必做综合23实验七重组质粒的酶切鉴定必做综合24实验八外源基因诱导表达及蛋白质检测必做综合212实验九细胞凝集反应必做综合22实验十细胞膜的渗透性必做综合22实验十一细胞工程基础实验技术必做综合24实验I•二无菌操作及愈伤组织诱导技术必做综合24实验十三微藻规模化培养必做综合245.实验环境生物技术专业实验室6・实验总体要求进入实验室，必须穿实验服。保持实验台的整洁，白己的物品需放置在指定位置，贵重物品随身携带

3、。7.本实验的重点、难点及教学方法建议本专业大实验主要包括基因克隆、克隆的鉴定、细胞生物学基本实验以及细胞工程基本实验技术。实验一Fl的基因的PCR扩增实验二DNA片段的回收实验三DNA的连接实验四大肠杆菌感受态细胞的制备实验五重组DNA的转化实验六快速分离大肠杆菌屮的重组质粒实验七重组质粒的酶切鉴定实验八外源基因诱导表达及蛋白质检测实验九细胞凝集反应实验十细胞膜的渗透性实验十一细胞工程基础实验技术实验十二无菌操作及愈伤组织诱导技术实验十三微藻规模化培养实验一目的基因的PCR扩增一、实验目的目的基因的分离技术是基因工程的三大核心技术Z—。应用PCR技术分离目的基因是

4、常用的方法Z-O通过木实验的学习，要求学生掌握PCR技术的基木原理；掌握用PCR技术扩增目的基因的方法。二、实验内容设计特异引物，以含有H的基因的质粒DNA为模板，用PCR方法扩增H的基因。三、实验要求集屮授课四、实验准备在进行实验Z前，要求学生在对课堂相关知识点理解和掌握的基础上，认真阅读木实验指导，并进行归纳总结，完成预习报告。五、实验原理.方法和手段PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的了链DNA的

5、过程。是一项DNA体外合成技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNAo可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。PCR反应体系包括五种成分：（1）模板DNA；（2）引物；（3）四种脱氧核糖核廿酸；（4）DNA聚合酶；（5）反应缓冲液（提供Mg2pH、离子强度）。PCR反应的基木步骤包括：（1）变性：高温使双链DNA解离形成单链（94°C）；（2）退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（55°C）；（3）延伸：DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70〜72°C）。PCR反应体系的总体积一般为25（.11-100glo为了提

6、高PCR的扩增效率，PCR反应体系中各成分的浓度按如下原则调控：（-）反应缓冲液：由纯水、KC1、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境屮反挥活性。KC1可降低退火温度，但不能超过50mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。Mg*终浓度为1.5〜2.0mmol/L,其对应dNTP为200pmol/L,注意Mg2与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2+,当dNTP浓度达到1mmol/L时会抑制Taq酶的活性。Mg2+能影响反应的特异性和产率。（二）BSA：—般用乙酰化的BSA,起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，

7、对Taq酶有保护作用。（三）dNTPs：dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.0〜7.5,—般存储浓度为10mmol/L,各成份以等当量配制，反应终浓度为20〜200pmol/L。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成木；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。（五）Taq酶：能耐95°C高温而不失活，其最适pH值为&3〜&5,最适温度为75〜80°C,一般用72°C。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按方向逐个将dNTP分了连接到引物的3,端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无3J5,的外切酶活性，没有校正功能。用