免疫学概论-第章-抗原和抗体制备与应用.ppt

《免疫学概论-第章-抗原和抗体制备与应用.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第一节天然抗原的制备一、颗粒天然抗原的制备二、可溶性抗原的制备一、颗粒天然抗原的制备1.细菌抗原2.血红细胞抗原和组织细胞粗抗原的制备1.细菌抗原(多用液体或固体培养物集菌后处理)1)H抗原(鞭毛抗原，蛋白质）:用有毒力的菌株，菌液用0.3％～0.5％甲醛处理2)O抗原（菌体抗原，细胞壁多糖抗原）:需要100℃加温2～2.5h后应用。3)Vi抗原（伤寒沙门菌的表面抗原，糖脂）：应在杀菌后再加0.5％～1％氯化钙溶液。有些细胞膜成分，如组织细胞膜、血细胞膜经打碎后亦可制成颗粒抗原。颗粒抗原悬液呈乳浊状，多采用静脉内免疫法，较少使用佐剂作皮内注射。细菌菌体抗原的制备流程图液体培养或

2、斜面培养富集菌体37℃24h100℃水浴2～2.5h杀菌无菌试验NS稀释成8～10亿/mlO菌体抗原返回4)菌苗用细菌体制成的生物制品a.活菌苗：制备关键:获得减毒或无毒菌株，但应保持免疫原性。优点;一般只需接种一次，且需量较小，但引起的免疫效果好，能维持较长时间。缺点:活菌苗需维持其活力，菌苗的保存需一定的冷藏条件，且有效期短。实例：预防结核病的卡介苗、鼠疫活菌苗等。b.死菌苗b.死菌苗制备关键：用化学或物理方法将病原菌杀死后仍可保持免疫原性特点:病原菌已被杀死，不能繁殖，用量较大，接种后可能出现局部肿痛或发热等全身反应;大多需多次接种。实例：霍乱、伤寒、副伤寒甲、乙混合菌苗

3、、百日咳菌苗等。2.血红细胞抗原和组织细胞粗抗原的制备绵羊红细胞抗原的制备组织和细胞粗抗原的制备绵羊红细胞的制备流程图摇动15-20min4℃可保存3周取适量NS洗涤3次2000r/min10minNS稀释至2～5%抗凝血剂天然抗凝剂（肝素）Ca+2鳌合剂（柠檬酸钠，氟化钾）有溶血现象应弃去2）组织和细胞粗抗原的制备处理好的组织用生理盐水洗去血迹及污染物。将洗净的组织剪成小块，进行粉碎。组织匀浆后通过2000～3000r/min离心10min后分成两个部分沉淀物含有大量的组织细胞和碎片---组织和细胞粗抗原；上清液作为提取可溶性抗原的材料，提取前还要通过1000～2000r/m

4、in20～30min的高速离心，以除去微小的细胞碎片，此时上清液应澄清来源:组织和细胞，其成分比较复杂1.组织和细胞成分混合抗原制备2.蛋白质抗原制备3.核酸抗原制备4.类脂多糖抗原制备5.免疫球蛋白片段制备二、可溶性抗原制备及鉴定可溶性抗原:蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸二、可溶性抗原制备及鉴定1.组织和细胞成分混合抗原制备程序上清液澄清所用材料必须是新鲜或低温保存的去除包膜或结缔组织脏器进行灌洗洗去血迹及污物NS内含0.5g／LNaN2冷浴中组织剪碎装入捣碎机简内高速粉碎制成组织匀浆液3000r／min×10min取上清液去除细胞碎片及微小组织

5、离心蛋白质抗原制备蛋白质是良好的抗原，要制备特异性高的抗血清通常需要纯化。可采用：1.超速离心法2.选择性沉淀法3.凝胶层析法4.离子交换层析法5.亲合层析法2.蛋白质抗原制备（自学）原理:利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉降速度的颗粒,处于不同密度的梯度层内，达到彼此分离的目的。1)．超速离心法特点：用超速离心或梯度密度离心法纯化抗原，极难将某一抗原成分分离出来。应用：用于少部分大分子抗原和一些比较轻的抗原物质的分离，如IgM、C1q、甲状腺球蛋白、载脂蛋白A、B等。2、选择性沉淀法原理：根据各蛋白质理化特性的差异，采用各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原成分沉

6、淀，从而达到纯化的目的。2)、选择性沉淀法常用方法：盐析沉淀法（不同盐浓度则溶解度不同）；常用33～50％饱和度的硫酸胺。特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。3．凝胶层析法（凝胶过滤法）原理：凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质，经适当溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种分子大小不一的混合物加在凝胶床面时，大分子物质不能进入凝胶颗粒的网孔结构内，在凝胶颗粒之间的空隙中很快地通过凝胶床，短时间内被洗脱出来；而分子较小的物质则进入凝胶网孔结构内，反复受到阻滞，洗脱较慢。分成大、中、小三种类型。3)．凝胶层析法（凝胶过滤法）原理：利用带离子基团的

7、纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白质的等电点不同，所带电荷不同，与纤维素结合的能力有差别。当梯度洗脱时，逐步增加流动相的离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位置，从而使血清中的蛋白质分成γ球蛋白、α球蛋白、β球蛋白和清蛋白等几个部分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。4)．离子交换层析法5．亲和层析法（亲和色谱）原理：依据抗原抗体的生物学活性进行分离和提纯的技术。将纯化的抗IgG附着于惰性的固相基质上，制成免疫吸附层析柱。当样品流过此柱时，待分离的IgG可选择性