PCR和原位PCR原理和方法.pdf

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1、PCR及原位PCR的原理和方法PCR的基本原理•聚合酶链反应PolymeraseChainReaction,PCR•又称体外基因扩增方法–这种技术与体内DNA复制（replication）过程相似。•DNA是储存遗传信息的生物大分子，由四种脱氧核苷酸（dNTP）组成：–腺嘌呤脱氧核苷酸（A）–鸟嘌呤脱氧核苷酸（G）–胞嘧啶脱氧核苷酸(C)–胸腺嘧啶脱氧核苷酸(T)•DNA的分子结构是由两条互相平行而方向相反的链借助碱基互补配对的原则（即A—T,G—C）而形成的双螺旋构型。–不同碱基的顺序，组成不同的遗传密码和信息，亲代细胞通过DNA复制成二分子顺序完全相同的DNA

2、，而传给子代细胞。PCR在体外进行的三个基本步骤组成PCR的循环反应0•第一步：变性Denaturation94C30s将所要扩增的基因片段加热，使双链DNA解离成单链DNA。0•第二步：复性Annealing（退火）55C30s当温度下降时，化学方法合成的寡核苷酸引物即与所要扩增基因两侧的DNA相结合。02+•第三步：延伸Extension72C60s在合适缓冲液、Mg及四种dNTP存在条件下，DNA聚合酶能忠实根据模板碱基顺序合成互补链，即从引物的3’端—OH进行延伸，合成的方向为5’3’，从而合成二分子与原来结构相同的基因片段。PCR操作方法试剂•引物：根

3、据待扩增DNA不同，引物也不同•耐热DNA聚合酶：此酶是从耐热细菌中分离出来的，能耐受高0温（93-100C）•10xPCR缓冲液：–500mmol/LKCl0–100mmol/LTris-HCl(pH8.4,20C)–150mmol/LMgCl2–1mg/ml明胶试剂•5mmol/LdNTP储备液•标本处理试剂:不同标本所需试剂不同*由于有些试剂及DNA聚合酶价格昂贵，因此，反应体积很小，常用终体积为50-100ul，有时为25ul。操作程序•将PCR的必需反应成分加入一微量离心管中，然后置于一定的循环参数条件下进行循环扩增。–(1)向一微量离心管中依次加入：•

4、ddH2O补至终体积（50-100ul）•10xPCR缓冲液1/10体积•dNTP各200umol/L•引物各1umol/L25•DNA模板10-10拷贝*混匀后，离心15s使反应成分集于管底。0–(2)加石蜡油50-100ul于反应液表面以防蒸发。置反应管于97C变性7min（染色体DNA）或5min（质粒DNA）。–(3)冷至延伸温度时，加入1-5UTaqDNA聚合酶，在此温度下作用1min。–(4)于变性温度下使模板DNA变性适当时间。–(5)在复性温度下使引物与模板杂交一定时间。–(6)在延伸温度下使复性的引物延伸合适的时间。–(7)重复（4）-（6）步2

5、5-30次。每次即为一个PCR循环。–(8)微量琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物。设置对照•阳性对照：含靶序列DNA样品•阴性对照：用三蒸水代替模板DNA影响PCR的因素模板核酸•进行核酸体外扩增的模板可为DNA或RNA–RNA的扩增需首先逆转录成cDNA后才能进行正常PCR循环。•核酸标本来源广泛–纯培养的细胞或微生物–临床标本（血、尿、粪便、体腔积液、漱口水等）–犯罪现场标本（血斑、毛发、精斑等）–病理解剖标本（新鲜的或经甲醛固定石蜡包埋组织）–考古标本模板核酸25•PCR反应中模板加入量一般为10-10拷贝的靶序列。•扩增靶序列的长度根据不同目的而不同。一般为50

6、0bp以内，以100-300bp为最好。引物•引物是指两段与待扩增靶DNA序列侧翼片段互补的寡核苷酸。•PCR扩增产物的大小是由特异引物限定–引物的设计与合成对PCR的成功与否有着决定性的意义。引物的长度大多数为20-30个碱基，只要引物不少于16个核苷酸即能保证PCR扩增的序列的特异性–一般引物的终浓度为0.2-1umol/L，在此范围内，PCR产物量基本相同。缓冲液•最为常用的缓冲体系为10-50mmol/L0Tris-HCl(pH8.3-8.8,20C).•如果PCR的产量低，可将Tris浓度增加至50mmol/L，此时pH为8.9会增加产量2+Mg2+•

7、Mg是TaqDNA聚合酶活性所必需的。2+•Mg浓度可影响：–酶的活性与忠实性–引物的复性–模板与PCR产物的解链温度–产物的特异性–引物二聚体的形成2+•Mg浓度过低时，酶活力显著降低2+•Mg浓度过高时，则酶催化非特异性的扩增。2+Mg2+•TaqDNA聚合酶需要的是游离Mg2+–PCR混合物中的DNA模板、引物和dNTP的磷酸基团均可与Mg结合，2+降低Mg实际浓度。2+–解决方法：PCR中Mg的加入量要比dNTP浓度高0.2-2.5mmol/L。三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)•在PCR的重复热循环过程中其热稳定性应为50循环后约50%仍为dNTP。•为维持P

8、CR产物量