临床生化检验—修第七章 代谢物酶法分析 肖 () ().ppt

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1、第七章代谢物酶法分析技术广州医科大学金域检验学院临床生物化学教研室肖洪广教学目标与要求掌握：代谢物酶法分析的概念，平衡法和速率法的测定的理论基础，脱氢酶指示系统和过氧化物酶指示系统及酶循环法测定的方法原理与评价熟悉：酶激活和酶抑制测定法方法原理与评价了解：试剂酶的质量要求，代谢物酶法分析技术的发展前景代谢物酶法分析技术的原理1单酶反应直接法2酶偶联法3酶循环测定法4酶激活与酶抑制测定法56试剂酶的质量要求7小结与展望目　录酶法分析（enzymaticmethod）是以酶促反应为基础，酶作为主要试剂测定酶促反应的底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂，以及酶偶联法测定酶活性等的一类方法。代谢物酶法

2、分析技术是指用酶法分析的方法来测定人体內的代谢物或代谢产物的技术。酶法分析酶活性单位1、惯用单位:由发明者自行命名，结果无可比性；（20世纪50年代）.2、国际单位:在特定条件下，1分钟能转化1微摩尔底物（µmol/min）的酶量为一个“国际单位”：（76年）;63年是25℃及最适条件下.3、Katal单位：在规定条件下，即每秒钟转化1个摩尔底物（mol/s）的酶量.定时法：将酶与底物在特定条件（缓冲液、温度等）下孵育，经过一定时间后，用终止液终止反应，通过化学或生物化学的方法测出底物或产物的总变化量，除以时间即可计算出底物消耗速度（－d[S]/min）或产物生成速度（d[P]/min），

3、将速度换算为µmol/min便是以国际单位表示的酶活性连续监测法：将酶与底物在特定条件（缓冲液、温度等）下孵育，每隔一定时间（2s∼60s）连续测定酶促反应过程中某一底物或产物的特征信号的变化，从而计算出每分钟的信号变化速率。连续监测法是在多个时间点连续测定产物生成量或底物消耗量，选取线性期的速率来计算酶活性，又称速率法。临床诊断MI的常用生化标志物血中浓度动态变化趋势心肌标志物分子量(kD)判断值出现时间（h）达峰时间（h）恢复时间（h）升高倍数Mb17.8100μg/L0.5～25～1218～305～20CK86200U/L3～810～3672～965～25CK-MB86>25U/L,

4、3μg/L3～89～3048～725～20LD135>200U/L8～1824～726～10d3～5LD1135>40%总LDLD1/LD2>18～1824～726～10d5～10cTnT39.70.5μg/L3～610～245～10d30～200cTnI22.51.5～3.1μg/L3～614～207～14d20～50临床常用的诊断急性心肌梗死常用标志物一览表肝脏疾病的三酶过筛试验（13000）ALT增高—肝实质细胞损伤;（83%）GGT增高—胆汁淤积和对肝的诱导作用;（95%）ChE降低—肝脏的蛋白合成能力。是判断肝脏疾病预后一个良好指标。（74%）合计（99%）AST：71%、ALP

5、：60%、LDH：34%血清酶浓度在pg—ng水平，化学检测浓度约mg—ug水平。酶测定方法1．绝对定量法：测定酶分子的绝对数量。2．相对定量法：测定酶分子的相对数量。（临床生化介绍）相对定量法测定酶活性的依据：质量作用定律。测定方法1、量气法：操作繁琐，灵敏度低，少用。2、比色法与分光光度法比色法：操作繁，技术要求高，灵敏度低，中止反应。分光光度法：测定范围广，灵敏度较高，不需停止反应不作标准曲线，可倒入酶偶联技术。3、荧光法和同位素法（放射性核素法）优点：灵敏度高，可提高2~3个数量级，人工合成底物。不足：技术掌握较难，试剂仪器要求高，易产生非特异性荧光干扰测定。4、其它方法：离子选择

6、电极法，旋光法、极谱法、高效液相色谱法。工具酶：作为试剂用于测定物质浓度或酶浓度的酶酶学分析方法内容：借助酶测定某化合物的浓度、借助酶测定另一种酶活力酶学分析类型1．代谢物浓度的测定1）终点法2）动力学法：零级反应及一级反应；2．血清酶测定动力学法:零级反应及一级反应；特异性高，血清等体液样品不需预处理就能测定，简化了实验程序。试剂酶大多是蛋白质，没有毒性，避免了化学品对环境的污染。酶促反应温和，制成试剂盒可适用于自动分析。代谢物酶法分析在准确性、精密度、灵敏度和线性测定范围等方面都优于传统的化学法。（血糖测定）酶法分析的主要优点代谢物酶法分析平衡法?（终点法）速率法（动力学法）第一节代谢

7、物酶法分析的原理平衡法是指标本中待测物的量有限，经过酶促反应逐渐被消耗，当剩余的底物量很小（<1%～5%）时，指示反应信号逐渐达到稳定，即通常所说的终点；所以又称为终点法(end-pointmethod)。平衡法的特点是测定底物的总变化量，即测定的是“浓度”。1、平衡法测定的理论基础--终点法一、平衡法积分得：米氏方程改写为式中[S0]为待测物，[St]为待测物至反应t时间后的浓度若反应达到平衡，假设，即[S0]－[St