［推荐精品］、胶乳偶联方案的输出.doc

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1、方案一实验方法：一步法共价结合实验步骤：1、配制50mM的MES反应缓冲溶液,pH值为6.0；2、将蛋白质溶解于反应缓冲溶液屮，其浓度为10mg/L；3、用反应缓冲溶液稀释胶乳微球，使其浓度为1%(W/V)；4、将上述蛋白质溶液与胶乳微球混合，混合后在温室培育20分钟；5、用去离子水配制EDAC溶液，浓度为10mg/mL(52umol/mL)；6、取计算量的EDAC溶液加到蛋白质与胶乳微球混合液屮；7、H]O.IM氢氧化钠(NaOH)溶液调整该反应混合液的pH值至6.5±0.2,在摇床温室培育2小吋；X、将未结合的蛋片质除去，贮藏于缓冲溶液屮。方案二实验方法：简单二步法共价结合实

2、验步骤：1、配制50mM的MES反应缓冲溶液,pH值为6.0；2、将蛋白质溶解于反应缓冲溶液屮，其浓度为10mg/L；3、用反应缓冲溶液稀释胶乳微球，使其浓度为1%（W/V）；4、ImL胶乳微球悬浮液，加入20mgEDAC,在室温培育40分钟，在20分钟后第二次加入20mg/mL；5、用相等体积的该缓冲溶液來洗涤胶乳微球，离心，用1倍体积的缓冲溶液重复处理；6、将蛋白质溶解于50-1OOmM的MES缓冲溶液卩，蛋白质浓度为1mg/mL；7、再将胶乳微球悬浮于去离子水或结合的缓冲溶液屮，迅速加入溶解的蛋白质,37°C搅拌反应3小吋；8、按ImL反应混合液加入2.5UL乙醇胺混合，搅

3、拌反应10分钟；9、除去未结合的蛋片质，贮藏与贮存的缓冲溶液屮方案三实验方法：牛成NHS■酯的屮间体二步法共价结合实验步骤：1、每ml反应混合物加入下列各物：a.去离子水是最后容积为l.OmL；b.0」mL的IOx的贮备缓冲溶液，其pH值为6.0-6.5(一般可用0.5MMES缓冲溶液)；胶乳微球最终浓度为1%(W/V)；c.0.23mL的5()mg/ml的NHS在去离子水屮的溶液；d.19.2mg/mL(100mM)的EDAC在去离子水屮的溶液2、在室温将此混合物反应15・30分钟，不断搅拌；3、用MES缓冲液或纯化水洗涤胶乳微球悬浮物，除去未反应的NHS和EDAC；4、重新将

4、胶乳微球在去离子水中悬浮，使其浓度为1%(w/v)；5、将结合的蛋白质溶于50-1OOmM的MES缓冲溶液中,浓度为lmg/mL；6、立即加入蛋白质溶液(胶乳微球、蛋白质和缓冲溶液的浓度分别为0.5%(w/v)、0・5mg/mL、25-50mM)；7、将混合物反应至少2小吋，轻轻搅拌；按ImL反应混合液加入2.5ML乙醇胺混合，搅拌反应10分钟；9、除去未结合的蛋白质和乙醇胺，贮于适宜的贮存缓冲溶液屮。附录试剂：MES缓冲液5()0mM和50mM；PH6.1；4°C储存(如果发黄或者污染，应倒掉)。EDAC盐酸1—乙基一3—二甲基氨基内基二酰亚胺；52umol/ml：分析天平称取

5、1OmgEDAC,加入1ml去离子水。(EDAC对潮气非常敏感，在水屮快速水解，EDAC储存于干燥器«

6、«,-5°C保存。)NHSN—疑基琥珀酰亚胺；50mg/ml水溶液蛋白质溶液蛋白质充分稀释溶解，浓度为1—10mg/ml技术说明:1•微球总表面积与其粒径成反比，抗体的具体用量需要根据使用微球的大小做相应改变；单位质量的微球表面积(m2/g):A/M=6/PD其屮D=微球粒径(pm)P=微球密度(聚苯乙烯1.05g/ml)例如：O・8pm的聚苯乙烯微球,A/M=6/1.O5XO.8=7.14m2/g1.6pm的聚苯乙烯微球,A/M=6/1.05X1.6=3.57m2/g0.8P

7、L,IOmg聚苯乙烯微球需加入125—250pL多克隆抗体1.6

8、dL,10mg聚苯乙烯微球需加入62.5—125pL多克隆抗体2.虽然疏水性吸附与缓冲液pH值无关，但反应缓冲液的pH值对被吸附蛋白质的构象有较大影响，进而影响其吸附效率。在等电点pH值条件下，更多的蛋白质疏水性吸附点暴露出来，利于其与微球作用；3.高效搅拌下，将微球分散液快速加入蛋白质反应缓冲液，可以获得最高的吸附效率和吸附均匀度；4.绝大部分的蛋白质很快被吸附，延长蛋白质与微球混合时间有助于蛋白质正确定位。SampieProtocolforTwo-StepCarbodiimideCouplingofProtei

9、ntoCarboxylatedMicrospheresMicrospheresshouldbeprotectedfromprolongedexposuretolightthroughoutthisprocedure・1.ResuspendthestockuncoupledmicrospheresaccordingtotheinstructionsdescribedintheProductInformationSheetprovidedwithyourmicrospheres.2.