基因工程技术生产重组蛋白.ppt

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1、利用基因工程技术生产重组蛋白从基因到蛋白的复制、转录和翻译过程功能蛋白组装什么是基因工程基因工程(GeneticEngineering)原称遗传工程。是指在分子水平上将一种或多种生物体(供体)的DNA片断（目的基因）与载体DNA分子（如质粒、病毒等）在体外进行拼接重组,产生新的自然界从未有过的重组DNA分子，然后转入另一种生物体(受体)内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状的技术。基因工程有时也称为重组DNA技术(DNARecombination)或分子克隆技术(MolecularCloning)。什么是重组蛋白重组蛋白是指将一种或多种生物体（供体）的基因导

2、入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出的蛋白质产物。应用基因工程技术构建重组细胞并通过重组细胞培养，令其超量合成其它生物体内含量极微但却具有极高经济价值重组蛋白是现代生物技术中最活跃的研究方向之一，广泛应用于生产药用蛋白质及代谢工程等领域。已经投放市场并正在研制开发的重组蛋白药物几乎触及到医药的各个领域，包括各种抗病毒剂、抗癌因子、抗AIDS药物、新型抗生素、重组疫苗、重组生长激素、重组干扰素、重组抗体、免疫辅助剂、抗衰老保健品、心脑血管防护急救药、生长因子以及诊断试剂等。重组蛋白的生产包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是外源基因

3、重组、克隆和表达载体以及基因工程菌（细胞）的设计与构建；而下游技术则涉及到含有重组外源基因的生物细胞（基因工程菌或细胞）的大规模培养以及外源基因表达的重组蛋白的分离纯化过程。重组蛋白生产基本流程图重组蛋白的整个过程由工程菌(细胞)的设计构建（上游技术）和基因产物（重组蛋白）的生产（下游技术）两大部分组成，前者的单元操作过程如下:(1)从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA(包括外源基因或目的基因)和载体分子切开(简称切);(2)用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，形成DNA重组分子(简称接);(3)借助于细胞转化手

4、段将DNA重组分子导入受体细胞中(简称转);(4)短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中(简称增);(5)筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞(简称检)。由此可见，基因工程的上游操作过程可简化为:切、接、转、增、检。TheDNAcontainingthegenemustbeisolatedawayfromitsgenomiccontextThatshouldbesimple–buttherearebigproblemsGeneofinterestCloningcansupplylargequantiti

5、esofrecombinantDNASinglebacteriumtransformedwithsinglecopyofplasmidwhichissubsequentlyreplicatedGrowthtoacolonyProvidesseveralmgofrecombinantDNAProvidesseveralmgofrecombinantDNAInoculateintoliquidbroth重组蛋白表达的典型穿梭载体。MCS=多克隆位点；Op=细菌复制起始位点；Mp=细菌中的选择性基因；ME=真核生物中的选择性基因；OE=真核复制起始位点；PE=真核启动

6、子；TE=真核中止子；hG=表达的外源基因。重组蛋白的表达系统所谓重组蛋白的表达系统，是指生产重组蛋白的基因工程宿主菌或宿主细胞。目前常用的表达系统宿主要有原核的细菌（主要是大肠杆菌，E.Coli.）和真核的酵母菌、昆虫细胞、动物细胞系以及近年发展起来的盘基网柄菌系统。1、原核生物表达系统细菌(E.coli.)2、真核生物表达系统酵母菌(Yeast)3、动物细胞4、昆虫细胞4、新型真核表达系统盘基网柄菌盘基网柄菌(Dictyosteliumdiscoideum)属于真菌界的粘菌亚界的聚粘霉纲(Acrasiomzcetes)。1869年真菌学家OskarBrefe

7、ld首次描述了盘基网柄菌。盘基网柄菌属D.discoideum由Raper1935年发现。在自然界中D.discoideum通过吞噬土壤表面的细菌摄取营养和繁殖。盘基网柄菌的生命周期生长阶段发育阶段—细胞聚集—细胞分化—移动—达到顶点—植物体生长阶段(growthphase)吞噬细胞胞饮无菌培养基(AX2,AX3和AX4)丝足伪足吞噬细胞(Phagocytosis）细胞聚集(Aggregation)细胞分化(Celldifferentiation)移动阶段(Migrationphase)假原质团(Pseudoplasmodium)Prestalkcells(15

8、%)Presporesc