柠檬酸发酵工艺.ppt

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1、第一章柠檬酸发酵工艺学三、黑曲霉柠檬酸生产菌的保藏方法1、斜面低温保藏法2、载体吸附保藏法3、真空冷冻干燥保藏法4、液氮超低温（-196℃）保藏法是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。黑曲霉在pH为2～3的环境中发酵蔗糖，产物以柠檬酸为主，只产极少量的草酸；当pH接近中性时则大量产生草酸，而柠檬酸产量很低。2.1概述2.2黑曲霉柠檬酸生产菌的选育及保藏2.3柠檬酸发酵机制及深层发酵工艺2.4柠檬酸的提取和精制2.5柠檬酸的质量标准及新工艺新技术2.3柠檬酸发酵机制及深层发酵工艺条件第一节柠檬酸发酵机制一、柠檬酸生物合成途

2、径1、黑曲霉柠檬酸生物合成途径葡萄糖经EMP、HMP途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰CoA，一方面经CO2固定化反应生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰CoA缩合生成柠檬酸。糖酵解途径葡萄糖6-磷酸葡萄糖6-磷酸果糖1,6-二磷酸果糖磷酸二羟丙酮+3-磷酸甘油醛磷酸二羟丙酮3-磷酸甘油醛1,3-二磷酸甘油酸3-磷酸甘油酸+ATP3-磷酸甘油酸2-磷酸甘油酸磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸+ATP激酶——凡是催化磷酰基键ATP分子转移到受体上的酶，都称为激酶HMP途径6-磷酸葡萄糖5-磷酸核酮糖5-磷酸核糖+5-磷酸木酮糖6-磷酸果糖+3-磷酸甘油醛磷酸-D-赤藓糖+5-磷酸木酮糖6-磷酸果糖+3

3、-磷酸甘油醛①EMP途径在黑曲霉柠檬酸生产菌中起重要作用。②研究发现黑曲霉中存在三羧酸循环的酶系，证明黑曲霉中存在三羧酸循环。③研究证实，CO2固定反应对柠檬酸积累具有重要的生理意义。④黑曲霉CO2固定中，存在两个CO2固定系统丙酮酸——→草酰乙酸Keq=0.818磷酸烯醇式丙酮酸——→草酰乙酸，Keq=0.049可见，黑曲霉柠檬酸生产菌中CO2固定反应主要是丙酮酸羧化酶催化的，黑曲霉中已提纯出此酶。柠檬酸生物合成途径三羧酸循环概要2、酵母柠檬酸生物合成途径解脂假丝酵母能利用烷烃、乙醇、乙酸发酵生成柠檬酸。酵母（烷烃）柠檬酸生物合成途径异柠檬酸裂解酶切割异柠檬酸产生乙醛酸和琥珀酸乙醛酸经苹果酸

4、合成酶催化，在水的存在下接受乙酰辅酶A的乙酸，生成苹果酸。NAD+:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（氧化态）NADH:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（还原态）NADP+:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（氧化态）NADPH:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（还原态）NAD++H++2e-=NADHNADP++H++2e-=NADPH辅酶，用来实现电子传递二、黑曲霉柠檬酸发酵的代谢控制1、黑曲霉柠檬酸积累的代谢调节第一个调节酶是磷酸果糖激酶（PFK酶）柠檬酸、ATP对该酶有抑制作用：↑生产菌需要解除该抑制AMP、无机磷、NH4+对该酶有活化作用↓实验表明，NH4+能有效的解除柠檬酸、ATP对该酶的抑制作用因此，生产上添加铵盐来增加

5、柠檬酸产量Mn2+的影响：Mn2+缺乏→菌体TCA酶活下降Mn2+缺乏→可能干扰蛋白质合成，导致蛋白质分解↓减少柠檬酸对该酶的抑制←NH4+水平升高第二个调节点：CO2固定的酶活力高，保证草酰乙酸的供应研究证实，柠檬酸的生成速度与CO2固定量有化学计量关系，CO2固定主要是丙酮酸羧化酶催化的，生成了草酰乙酸。第三个调节点：TCA环上的调节柠檬酸合成酶，是一种调节酶，但在黑曲霉中没有调节作用顺乌头酸水合酶、异柠檬酸酶pH2.0时，失活阻断TCA循环柠檬酸合成酶活性很高时积累柠檬酸顺乌头酸水合酶需要Fe2+在发酵液中添加黄血盐，络合Fe2+阻断TCA循环，积累柠檬酸黑曲霉除正常呼吸链（产生ATP）

6、之外，还存在一条侧呼吸链（不产生ATP）缺氧对侧呼吸链的损伤是不可逆的，因才在产酸阶段，一定要保证足够的溶氧供应。三、黑曲霉柠檬酸的发酵机制归纳由于严格限制供给锰离子，筛选出耐高浓度金属离子的菌株，使细胞中形成高水平的铵离子，从而解除了柠檬酸和ATP对PFK酶的反馈抑制，使EMP途径的代谢流增大。存在一条呼吸性强的侧系呼吸链，不产生ATP，缺氧则呼吸链失活，细胞内ATP浓度下降，减轻了ATP对PFK酶的抑制，促使EMP途径的畅通，增加柠檬酸的生物合成。丙酮酸羧化酶是组成性酶，不受代谢调节控制，可源源不断地提供草酰乙酸，丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和草酰乙酸的供给，柠檬酸合成酶又基本上不受调节或

7、极微弱，增强了柠檬酸的合成能力。α-酮戊二酸脱氢酶受葡萄糖（蔗糖）和铵离子阻遏，使黑曲霉中的TCA循环变成“马蹄形”的代谢方式，减弱TCA循环，降低细胞内ATP浓度，另外使α-酮戊二酸浓度升高，又反馈抑制异柠檬酸脱氢酶，降低柠檬酸的自身分解。顺乌头酸水合酶催化时建立柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸：=90：3：7的平衡，顺乌头酸水合酶的作用总是趋向于合成柠檬酸，即柠檬酸分解活力低。一旦柠檬酸浓度升高到某