乳酸菌的分离纯化.ppt.ppt

《乳酸菌的分离纯化.ppt.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、乳酸菌素Lactocin-J23的分离纯化制备乳酸菌素Lactocin-J23的发酵液分离纯化的方法(NH4)2SO4盐析法沉淀乳酸菌素菌体细胞吸附纯化乳酸菌素阳离子交换法分离纯化乳酸菌素疏水层析法分离纯化乳酸菌素乳酸菌素纯度的测定(NH4)2SO4盐析法原理是根据蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当(NH4)2SO4加入蛋白质溶液，(NH4)2SO4对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，(NH4)2SO4加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白

2、溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。步骤实验1.取乳酸菌发酵上清液，放置于磁力搅拌器上，缓慢搅拌加入预先称量好的(NH4)2SO4固体粉末至所需饱和度，操作必须在10-15min内完成；2.4℃放置过夜，使其充分沉淀，10000rpm离心20min弃上清，用生理盐水溶解沉淀；3.以0.02%mol/LpH7.4PBS溶解装入2000Da透析袋，4℃透析12h；4.取透析袋内样品Bradford法测定蛋白含量。实验结果及分析1.以(NH4)2SO4盐析法沉淀菌株Lactocin-J23发酵上清液中的细菌素，盐析曲线如图。从图可知，随着(NH4)2SO4饱和度的提高，沉淀中乳酸菌细菌素和可

3、溶性蛋白质的量逐渐增加。在(NH4)2SO4饱和度达到40%之前，沉淀中基本没有表现出抗菌活性。随着(NH4)2SO4饱和度的增加，沉淀中开始表现出抗菌活性，但一直增加到(NH4)2SO4饱和度达到80%时，沉淀中的抗菌活性虽然持续增加，但仍然没有抗菌活力达到最大值的拐点出现，暗示发酵上清液中仍然有部分抗菌肽没有完全沉淀。综合分析实验结果表明(NH4)2SO4盐析法虽然是一种常见的蛋白质分离操作单元，但在分离菌株Lactocin-J23产生的细菌素时候存在杂蛋白多，目标产物得率低等缺点，再加上菌株LactocinJ23分泌合成目标抗菌肽的量较少，综合上述原因确定(NH4)2SO4盐析法不适

4、合于抗菌肽Lactocin-J23的分离纯化。实验步骤：1.乳酸菌发酵液在70℃水浴加热25min后调至吸附适宜pH，同时Bradford法和琼脂扩散法分别测定发酵液蛋白含量和抗菌活力；2.置于磁力搅拌器上室温搅拌30min，使细菌素充分吸附在细胞上；3.离心收集细胞，4℃于8000rpm/min离心30min，同时测定离心上清液中蛋白含量和抗菌活力；4.收集沉淀用与吸pH值相同的5mmol/L磷酸钠缓冲液洗涤细胞1-2次；离心30min收集沉淀悬浮于100mmo1/LNaC1溶液，用5%磷酸调至最佳解吸pH；6.4℃磁力搅拌12h，4℃于10000r/min离心30min，收集上清液0.

5、22um无菌滤膜过滤,上清液即为细菌素提取物；同时测定离心沉淀中蛋白含量和抗菌活力，以便计算抗菌肽损失率。结果与分析2.1pH对菌体细胞吸附Lactocin-J23的影响菌体细胞吸附法是基于细菌素在不同的pH条件下，细菌素和产生菌菌体细胞之间存在不同程度的吸附和解吸附现象。因此在利用菌体细胞吸附法纯化Lactocin-J23之前，利用琼脂扩散法以抑菌圈为活性指标，考察了不同pH范围条件下产生菌Lactic和革兰氏阳性指示菌（枯草芽孢杆菌）菌体细胞吸附Lactocin-J23的影响，结果见图2。图2菌株J23与指示菌对细菌素Lactocin－J23的吸附率从图2中可知，不同pH对J23菌体和

6、指示菌细胞吸附Lactocin-J23的能力有很大的影响。对产生菌J23来说，在pH6.0时吸附率最大，达到80%；当pH低于3.0或大于8.0时吸附率基本为0。对革兰氏阳性指示菌（枯草芽孢杆菌）来说，在pH为2-9之间均能吸附上目标细菌素，在酸性条件下其吸附能力较碱性条件下强，最大吸附率为55%，低于J23菌体的最高吸附率。因此在后续实验中确定在pH6.0时吸附Lactocin-J23,在pH2.0时从细胞表面解吸附。2.2产生菌J23细胞吸附纯化Lactocin-J23将活化的菌株J23接种到1000mlMRS液体培养基中，37℃培养24h，70℃水浴加热25min，待冷却后根据上述研

7、究结果调节发酵液pH至6.0，在室温缓慢搅拌2h，调节pH至2.0，分离纯化目标细菌素LactocinJ23，结果如表所示。从表1可知，菌株J23菌体细胞吸附-解吸附过程细菌素Lactocin-J23相对于粗发酵液纯化了23.52倍，比活力由55.65AU/mg提高到1309.09AU/mg，回收率为22.5%。与(NH4)2SO4盐析法相比，具有菌体细胞吸附法具有步骤少、操作简易、成本低、回收率较高等优点，可取代盐析法