微生物染色技术.doc

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1、简单染色法革兰氏染色法正染色抗酸染色法死菌鉴别染色法芽孢染色法姬姆萨染色法细菌染色法负染色：荚膜染色法活菌：美蓝或氧化三苯基四氮唑（TTC）染料：染料是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。前者赋予染料颜色特征，后者使染料能形成盐。染料通过离子键、共价键或疏水作用实现染色常用的微生物细胞染料都是盐，分酸性染料和碱性染料两大类：美蓝（即亚甲蓝）、结晶紫、碱性复红、番红（即沙黄）、孔雀绿等都属于碱性染料；酸性复红、伊红及刚果红属于酸性染料。碱性染料带正电荷酸性染料带负电荷。微生物染色原理：在中性、碱性或弱酸性溶液中，

2、细菌细胞通常带负电荷；碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，易与细胞结合使其着色。细胞处于酸性条件下（如细菌分解糖类产酸），所带正电荷增加，可采用酸性染料染色。染色种类:简单染色：利用单一染料对菌体进行染色。常用碱性染料进行简单染色，这是因为：细菌的等电点较低，pH值大约在2—5之间，故在中性、碱性或弱酸性溶液中，菌体蛋白质电离后带阴电荷；而碱性染料电离时染料离子带阳电。因此，带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。所以，在细菌学上常用碱性染料进行染色。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。操作步骤1

3、．涂片：用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜。2．干燥：可自然晾干，或将涂片置于火焰高处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤。3．固定：手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过迅速通过火焰2-3次（用手指触涂片反面，以不烫手为宜）。4．染色：加适量(以盖满菌膜为度)结晶紫染色液(或石炭酸复红液)，染l～2min。5．水洗：用自来冲洗至流下的水中无染色液的颜色时为止。6．干燥7．镜检鉴别染色：使用两种以上的染料进行染色，以区分不同类群的细菌，如革兰氏染色。革兰氏染色:原理：G-菌的细胞壁中含有较多易被

4、乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basicdye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorisingagent）和复染液(counterstain) 。用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫(cryst

5、alviolet)。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和力或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落。不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精(ethanol)。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，常用的复染液是番红。操作步骤：革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤1.制片（涂片干燥固定）2.初染：加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染液染色1分钟；倾去染色液，用水小心

6、地冲洗。3.媒染：卢戈氏碘液，媒染1min；用水洗去碘液。4.脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色10s-18s至流出液无色，立即水洗。5.复染：滴加番红复染1min；10.水洗：用水洗去涂片上的番红染色液。6.镜检：将染好的涂片用吸水纸吸干，镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。革兰氏染色结果影响因素：1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。2.菌龄也有影响。若菌龄太老，由于菌体死亡或自

7、溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。3.不要涂片太厚，会造成假阴性或假阳性。