Westernblot试剂配制及操作流程.doc

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1、Western-Blot操作流程试剂配制蛋白提取试剂1.RIPA裂解液：50mMTris（MW121.14，PH7.5）3.02g150mMNaCl4.38g1%TritonX-1005ml1%脱氧胆酸钠5g0.1%SDS0.5g蒸馏水至500ml。调pH值至7.5。混匀后4℃保存，长期保存于-20℃。使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。2.蛋白酶抑制剂cooktail所需母液成分：（1）100mmol/LPMSFPMSF17.4mg异丙醇1ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。（2）10mM亮肽素leupeptin:-20℃保存（3）2.1mg

2、/ml抑肽素Aprotinin:4℃保存配制：成分终浓度每ml裂解液所加母液量PMSF1mmol/L（储存浓度稀释100倍）10ulLeupeptin0.1mmol/L（储存浓度稀释100倍）10ulAprotinin1ug/ml（储存浓度稀释2000倍）0.5ul各成分直接加入所用的RIPA裂解液中，之后按照60ul/孔（12孔板）提取蛋白。蛋白定量试剂1.G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用）考马斯亮蓝G250100mg95％乙醇50ml85％磷酸100ml蒸馏水至1000ml配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存于棕色

3、瓶中。2．牛血清白蛋白BSA储存液（1mg/ml）：100mgBSA粉末溶于20ml双蒸水，定容至100ml，加少量防腐剂，4℃保存。上样用试剂1．4X上样缓冲液1.0mol/LTris·HCl（pH6.8）2mlSDS0.8g溴酚蓝0.04g甘油4ml去离子水定容至10ml。混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。使用时稀释成1X。2．1.0mol/L二硫苏糖醇（DTT）（10X）用20ml0.01mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09gDTT,分装成1ml小份储存于-20°C。使用时稀释成1X。例如：上样量20μl--4X上样缓冲液5μl+DTT2μ

4、l+样本蛋白13μl工作液制胶用（1-6）：1.1.0mol/LTris·HCl（pH6.8）Tris(MW121.14)12.114g蒸馏水100ml溶解后，（用浓盐酸调pH至6.8），室温下保存。2.1.5mol/LTris·HCl（pH8.8）Tris(MW121.14)18.171g蒸馏水100ml溶解后，（用浓盐酸调pH至8.8），室温下保存。3.10％SDSSDS10g蒸馏水至100ml如溶解困难，可在50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。1.10％过硫酸胺（AP）过硫酸胺0.1g蒸馏水1ml（现用现配，可先将过硫酸胺

5、干粉称好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后，4℃保存，保存时间为1周）5．四甲基乙二胺原液（TEMED）：4°C保存。6．30%丙稀酰胺：4°C保存。10%下层胶（两块胶，15ml）：依次加入去离子水5.9ml30%丙烯酰胺5ml1.5MTris-HCl（pH8.8）3.8ml10%SDS150μl10%AP150μlTEMED6μl每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。灌胶后加正丁醇（1ml）消泡5%上层胶（两块胶，6ml）：依次加

6、入去离子水4.1ml30%丙烯酰胺1ml1MTris-HCl（pH6.8）0.75ml10%SDS60μl10%AP60μlTEMED6μl每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。7．5X电泳液缓冲液Tris（MW121.14）15.1g甘氨酸（MW75.07）94gSDS5.00g蒸馏水至1000ml溶解后室温保存,用时稀释5倍，通常取160ml配制成800ml即可。5．10X转膜缓冲液甘氨酸（MW75.07）151.1gTris（MW121.14）30.3g蒸馏水至1000

7、ml溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至20%。通常取80ml母液，加560ml蒸馏水，最加160ml甲醇，配制成800ml即可。（先加甲醇易产生沉淀）6．10XTBS缓冲液Tris（MW121.14）24.2gNaCl80.0g蒸馏水至1000ml（浓盐酸调pH至7.6），溶解后室温保存。10．1XTBST缓冲液10XTBS缓冲液100ml蒸馏水900mlTween-201ml因Tween-20比较粘稠，应缓慢吸取并可把枪头剪掉一块，即可防止产生气泡。溶解后室温保存。11．封闭液/抗体稀释液（5%脱脂牛奶)：1XTBST缓冲液95-100ml脱脂奶粉5