HPV疫苗的制备-马小艮.doc

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1、HPV疫苗的制备及作用效果HPV是一类能够感染皮肤和粘膜的DNA病毒。高危型HPV是宫颈癌以及癌前病变的要致病因子，99.7%的宫颈癌组织都检测出高危型HPV。针对HPV感染，人类自身所产生的免疫应答主要分为体液免疫和细胞免疫。体液免疫主要表现为HPV刺激机体B细胞产生抗HPVL1、L2蛋白的抗体，但是由于产生抗体的量特别少，所以很难检测到这些特异性抗体，阻碍了人们对体液免疫的相关研究。细胞免疫主要表现为T细胞受HPV刺激后通过释放淋巴因子来杀死感染病毒的细胞[1,2]。目前预防和治疗HPV相关癌症最有效的方法是研制其特异性的HPV疫苗，诱导机体产生

2、中和抗体，激发保护性免疫反应，以达到预防HPV相关癌症发生和传播的目的，既可以降低宫颈癌的发病率，也可降低与HPV感染有关的其它癌症的发病率。人类乳头瘤病毒（HPV）是一种无包膜的双链闭环小分子DNA病毒，属乳头多瘤空病毒科乳头瘤病毒属。其基因约8kb，只有1条DNA链可作为转录模板，含8个开放阅读框（openreadingframes，ORFs），分3个基因区，即早期区(earlyregion，E区)、晚期区（lateregion，L区）与非编码区（uncodingregion，UCR）或上游调控区（URR）。E区编码E1，E2，E4，E5，E6，

3、E7等早期蛋白，参与病毒DNA的复制、转录、翻译调控和转化等功能；L区编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2；UCR区含有HPV基因组复制起点和HPV表达所必需的调控元件。由ＨＰＶ产生的两种癌蛋白是Ｅ6和Ｅ7，可以抑制细胞周期负调节因子的活性，并可以在肿瘤细胞中高度表达。而晚期基因则编码衣壳的结构蛋白，其中主要衣壳蛋白Ｌ1结构保守，是ＨＰＶ衣壳的主要成分，约占衣壳蛋白的80%以上，因此成为理想的预防免疫靶位。基于HPV的致病机制和天然的免疫原性，HPV疫苗研究聚焦于L1、E2、E5、E6和E7。目前HPV的疫苗主要分为预防性疫苗和治疗性疫苗。预防性疫

4、苗主要诱导机体体液免疫反应，产生的中和性抗体在HPV进入机体前即能与病毒的抗原结合，从而防止HPV的感染。治疗性疫苗主要引起机体的细胞免疫反应，产生的活化效应性T细胞能识别和攻击HPV感染的细胞，其中也包括HPV引起的恶性肿瘤细胞。（一）HPV预防性疫苗1.预防性疫苗的制备依据及过程预防性疫苗一般以HPV主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2为靶抗原[3],其作用在于诱发肌体产生特异性的中和抗体和有效的局部免疫反应,以阻止HPV的长期感染和再感染。HPV的衣壳蛋白在真核以及原核表达系统中表达时,能自我装配或形成病毒样颗粒(virus-likepartic

5、les,VLPs),其结构和抗原表位与天然的病毒颗粒十分相似，将其置入机体后可刺激产生中和抗体IgG和IgA[4]，达到预防相应型别HPV的感染，而且不包括病毒DNA，安全性好，能有效地保护人类和动物免受乳头瘤病毒的感染以及产生相关肿瘤的可能性[5,6]。VLPs颗粒直径为50-55nm，分子量为55-60kDa，VLPs是由纯化的L1蛋白装配形成HPV的空衣壳。VLPs的最小结构单元是L1蛋白单体，L1蛋白主要是由8条反向平行的β折叠肽链段构成的，它们之间是由无规则的环形区（loop）连接在一起的，每个环形区大约有10~30个氨基酸（aa），这些区

6、域绝大部分延伸到五聚体和病毒颗粒的外表面，是抗原表位的所在区域[7-9]；不同型别HPV环形区的序列和空间结构是不同的，所以HPV具有高度的型别特异性。因此，目前对于HPV抗原表位的研究主要集中在L1蛋白的环形区上[10]。国内外有多家机构在进行HPV疫苗的研究及其制备，大部分都是以L1和（或）L2蛋白为靶标进行制备的（单独表达L1或者联合表达L1+L2，获得病毒样颗粒(VLP)）。一般步骤都是针对HPVL1和（或）L2蛋白的核酸序列为基础，对其进行改造优化（例如密码子优化，删除部分序列，替换某个/些碱基，连接其他基因等），扩增或者合成优化后的序列，

7、然后将其克隆到表达载体上，并在原核系统（例如大肠杆菌）或者真核系统（例如昆虫细胞，酵母，哺乳动物细胞等）进行表达，再将表达的单个蛋白或者融合蛋白分离纯化，添加佐剂后制成疫苗，通过将制成的疫苗免疫小鼠或者其他动物对其免疫原性进行评价，效果较好的进行临床实验。2.已经被批准上市的预防性疫苗目前已经被批准上市的预防性HPV疫苗有两种，它们分别是英国葛兰素（GlaxoSmithKline，GSK）公司的双价疫苗“Cervarix”和美国默克（Merck&Co.,Inc.）公司生产的四价疫苗“Gardasil”（商品名）[11]。随着这两种疫苗的上市，人们对宫

8、颈癌疫苗的研究主要集中在HPVVLPs疫苗上。2006年，“Gardasil”被批准上市，这是第一个商品化的