核酸凝胶电泳.终.ppt

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1、核酸凝胶电泳什么是电泳？带点颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳。生物大分子如蛋白质，核酸，多糖等大多都有阳离子和阴离子基团，称为两性离子在电场中，带电颗粒向正极或负极迁移，迁移的方向取决于它们带点的符号。凝胶电泳有几类？一·琼脂凝胶电泳（分辨DNA范围为0.2~50kb)二·聚丙烯酰胺凝胶电泳（分辨范围为1~1000kb）三·脉冲电场凝胶电泳（分离到高达107bp的DNA大分子）前言；核酸凝胶电泳是分子克隆技术之一，用于分离·鉴定和纯化DNA或RNA片段。核酸凝胶电泳的基本原理凝胶电泳的原理比较简单。当一种带电分子放在电场当中时，它们就会以一定的速度移向适当的电极。带点分

2、子在电场作用下的移动速度，称之为电泳迁移率，它同电场的强度和电泳分子本身携带的静电荷数成正比。也就是说，电场强度越大，电泳分子所携带的静电荷越多，其移动速度也就越快，反之则慢。在哪电泳中，使用无反应活性的琼脂糖与聚丙烯酰胺凝胶作支持介质，从而将电泳分子的对流运动降低到极低，使电泳分子的移动速度与其分子的摩擦系数成反比。已知摩擦系数是分子大小、极性及介质黏度的函数，因此根据分子大小的不同、构型或形状的差异，以及所带净电荷的多寡，便可以通过电泳将核酸或蛋白质分子混合物中的各种成分彼此分离开来。在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子状态的。从这种意义上讲，DNA和RNA的多核苷

3、酸链可称为多聚阴离子。因此，当核酸分子被放置在电场当中时，它们就会向正极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相当数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向迁移。在一定的电场强度，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳迁移率，取决于核算分子本身的大小和结构。分子质量较小的DNA分子比分子质量较大的DNA分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子质量的的松散型的开环DNA分子或线性分子要快些。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。常见的电泳仪水平电泳仪垂直电泳仪脉冲电泳电泳的梳子电泳槽电泳仪一·琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖

4、作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关。分辨DNA片段范围0.2~50kb；而要分辨较小分子质量的DNA片段，则要用聚丙烯酰胺凝胶，其分辨范围为1~1000bp。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力也就越强；反之，浓度越低，孔隙就增大，其分辨能力也就越弱。DNA分

5、子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。琼脂糖凝胶电泳的操作操作步骤：配胶EB染色点样胶图分析成像拍照电泳1、配胶按所要分离的DNA分子的大小，称取适量的琼脂糖粉末，放入锥形瓶，加适量1×TAE电泳缓冲液；然后置微波炉内加热摇匀至完全溶化成透明状，适当冷却后倒入胶托；胶完全冷凝后放入电泳槽，电泳槽里的缓冲液必须没过胶面。铺胶凝胶凝固后取出梳子加缓冲液2、EB染色溴化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱

6、基之间。在在紫外照射EB-DNA复合物时，出现不同的效应。注意：严格区分污染区和非污染区，不把污染区的物品拿到非污染区碰过EB的手套要及时丢弃！3、点样根据样品不同可分两种点样体系：A、样品+6XloadingbufferB、样品可以直接点样4、电泳点完样后连接电源，设置好电源的参数，开始电泳。当溴酚蓝的带（蓝色）的移动至一定长度即可停止电泳。电压要求：≤20V/CM胶，在样品出孔用低压（3V/CM，15min）,然后调回标准电压，跑出的条带较好。成像拍照胶图分析注意事项一、配胶1.电子称的使用，要时刻注意保持电子称的精确性，保持清洁，根据不同的浓度的胶称取琼脂糖。2.加TAE的量要适当，以

7、避免配出来的胶太薄导致胶孔太浅或浓度太低。3.倒胶前胶托一定要洗干净，并檫干。倒胶时要待胶冷到一定温度摇匀尽量不要产生气泡。若胶液的温度太高胶托容易变形。二、EB染色1.碰到EB的手套要及时丢弃。2.加量要适当，加EB至终浓度0.5μg/ml3抹布要严格区分，不可交叉使用。三、点样电泳1.加样时，枪头要上紧，吸样均一准确，排液时吸头不要有残留。2.点完样后及时盖上胶垫，注意不要盖反。3.点电泳前最好检查待用胶