PCR的原理与应用.ppt

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1、第二章PCR技术的原理及应用故事发生在1983年的春夏之交KaryB.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。他原本是要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA的想法…...很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖，Mullis是其中之一Mullis开车的时候,瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA

2、，……Mullis的第一个PCR实验1983年9月中旬。Mullis在反应体系中加入DNA聚合酶后在37℃一直保温。结果第二天在琼脂糖电泳上没有看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。第一种高温菌DNA聚合酶的分离美国黄石国家公园ThermusaquaticusTheThermusaquaticusDNApolymeraseTaqNotpermanentlydestroyedat94ºCOptimal

3、temperatureis72ºC耐高温DNA聚合酶的种类TaqDNA聚合酶(Thermusaquaticus，Cetus/Roche)TthDNA聚合酶(Thermusthermophilus，Toyobo)PfuDNA聚合酶（Pyrococcusfuriosus，Stratagene）DeepVentDNA聚合酶(Bio-labs）TflDNA聚合酶（Thermusflavus，Promega)TliDNA聚合酶(Thermococcuslitoralis，Promega)VentDNA聚合酶(Bio-l

4、abs）PwoDNA聚合酶(Pyrococcuswoesei，Roche)PfxDNA聚合酶(Thermococcuskodakaraensis,Invitrogen)DynazymeDNA聚合酶（Thermusbrockianus，Finnazyme）FDDNA聚合酶(Thermussterophilus？，复旦大学)Tma,Tne,KOD,……PCR仪器的变迁三个水浴锅，用手移动（Mullis等人当时用的）电加热块＋自来水冷却（PE，1988）电加热块＋内置循环液冷却（PE，1989）三个加热块＋机械手（

5、Stratagene，1994）半导体制冷和加热（MJ,PE,BioMetra,Eppendrof）温度梯度,荧光检测(如Roche的Lightcycler)风加热Lab-on-chip式的PCR仪(所谓的芯片PCR)中国的状况1991年出现三个水浴锅+机械手的原始PCR仪（华美，复日等）现在以半导体（Peltier板）制冷式为主（杭州博日,上海天呈,厦门安普利等）PCR的发展史1983年春，Mullis发展出PCR的概念；1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验，只用一个循环；

6、1983年12月，用同位素标记法看到了10个循环后的49bp长度的第一个PCR片断；1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒；1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202），这回Mullis是第一发明人。1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法；1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，TaqDNApol

7、ymerase，这是85年春天Mullis建议做的；1988年，第一台PCR仪问世；1991年，HoffmanLaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权。PCR不只是一个方法改进Mullis的上司有句“名言”，“我们要扩增这么多DNA样品有什么用”；到了1991，Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR相关专利转让给瑞士HoffmanLaRoche公司，并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红；Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA重组技术一样意义深远。PCR相关的术语和产品

8、层出不穷T-vectorHotStartTaqRT-PCRRAPD-PCRDDRT-PCRLM-PCRInversePCRNestedPCRReal-timePCRRACEFlowchipPCRTASMultiplexPCRImmunoPCRAsymmetricPCRLP-PCRNASBARecombinantPCRAFLPSSCPInsituPCRTaqMan/SYBRgreen1stcycle2