全人源单抗-修美乐.ppt

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1、全人源单抗-修美乐Contents:研发背景分子基础以及构建安全及有效性评价前景展望一、研发背景巴斯夫旗下诺尔药业英国剑桥抗体技术公司CAT噬菌体展示技术→筛选得到某一特定抗原表位的TNF抗体→人源化加工处理→得到第一个完全人源化抗TNF-α单抗药物D2E7Ⅱ期临床试验证明有疗效继续研发、建立营销渠道需要很大投入巴斯夫回归化学主业剥离诺尔药业2000年，雅培以69亿美元收购诺尔药业及其所有上市和在研产品。1993年一、研发背景2003年1月首次在美国上市，美国食品药品管理局（FDA）批准用于治疗中到重度类风湿关节炎雅培耗资10亿美元以扩展该药的新适应症：银屑病关节

2、炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、斑块型银屑病、多关节型幼年特发性关节炎2012.10，美国FDA批准了该药的第七个适应症:溃疡性结肠炎。这使得修美乐将在慢性病领域发挥作用，并影响美国的62万患者。修美乐在溃疡性结肠炎这一领域的使用，为其增加额外的5亿甚至更多的销售额。修美乐可以预见适应症还将继续拓宽，2015年已经分别向FDA和欧洲药管局（EMA）提交了该药物用于化脓性汗腺炎的新药上市申请。一、研发背景2012年起，修美乐就以94.8亿的成绩稳坐全球药物销售排行榜榜首。2015年的销售额更是达到了140.9亿元。新药层出不穷，修美乐能够荣登全球畅销药之首的主要原因是：

3、产品过硬、适应症广、受众群大，能解决临床上的迫切需求。2013年，雅培宣布进行拆分，修美乐被划归为专注于生物制药研发的新公司艾伯维旗下全人源抗体制备的四种途径:一.从采集的病人血样中构建Fab或者ScFv文库，并通过噬菌体展示筛选抗体库，来产生人源MAb。二.用含有人免疫球蛋白基因位点的转基因小鼠进行免疫，可以产生人抗体的免疫应答，这样通过传统的杂交瘤技术可以来生产人源MAb。二.分子基础以及构建全人源抗体制备的四种途径:三.通过分离培养人外周血淋巴细胞或扁桃体淋巴细胞，然后用抗原进行免疫刺激，产生免疫应答，然后再和人类骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，经筛选得到人源

4、单克隆抗体，并立即进行分子克隆抗体基因，必要时通过亲和力成熟技术提高其与药靶抗原的亲和力，再克隆进入可长期稳定表达的哺乳动物细胞来表达目的抗体，这种抗体完全是在人细胞环境中生成的。四.通过分离和低密度(约500B细胞每96孔)培养人外周血淋巴细胞或扁桃体淋巴细胞，对培养上清进行抗原特异性筛选，对阳性孔B细胞进行分子克隆获得人抗体基因，再使用其他可长期稳定表达的哺乳动物细胞来表达目的抗体。二.分子基础以及构建阿达木单抗是重组人源IgG1单克隆抗体，阿达木单抗含有人源轻链和重链可变区序列和人源IgG1，κ链恒定区序列，包括1330氨基酸残基，分子量大概有148kD。该

5、抗体对hTNF-α具有很高的亲和性（Kd=10-8Morless）和比较低的解离速率（Koff=10-3/sorless)，阻止其与细胞表面的TNF受体p55，p75位点结合，能够使体内表面TNF表达的细胞裂解，导致TNF水平降低。能够中和hTNF-α的活性包括hTNF-α诱导的细胞毒性和细胞活化作用。关于D2E7的结合特异性，其可与各种形式的hTNFα结合，包括可溶性hTNFα，跨膜hTNFα和与细胞受体连接的hTNFα。D2E7不会与其它细胞因子特异性结合。二.分子基础以及构建轻链可变区序列二.分子基础以及构建D2E7的一级结构重链可变区序列二.分子基础以及构

6、建重组人源抗体的筛选1.建立人源scFV噬菌体抗体库。其是从人类淋巴细胞中分离的编码重链和轻链可变区的mRNA经噬菌体展示技术得到的。2.为了分离与hTNFα具有高亲和力和低解离率的人源抗体，选择对hTNFα具有高亲和力的鼠源抗体（MAK195）用抗原表位印记（epitopeimprinting)的方法选择对hTNFα具有亲和力的人源序列。3.选好了VH和VL片段之后，“mixandmatch”实验用来筛选合适的VH和VL配对。4.获得编码合适抗体的DNA序列后，亚克隆于其它表达载体进行表达。二.分子基础以及构建获取编码抗体轻链和重链可变区的DNA片段二.构建过程

7、经突变后编码D2E7或者D2E7相近抗体的氨基酸序列。通过重组DNA技术进行下一步操作表达载体的构建人源序列的突变通过标准方法获取。例如:PCR介导的突变（即通过引物使突变的核苷酸插入）或者定点突变抗体的表达这可通过PCR对人源轻链和重链的修饰和扩增获得。例如为了获得D2E7或与其相近抗体的编码重链可变区的DNA片段，人VH基因的VH3基因家族中某一基因（DP-31)通过PCR进行扩增。为了获得轻链可变区基因片段，人VL基因的VκI家族中的某一基因（A20）通过PCR进行扩增。如何获取？例如把可变区序列转变为完整的抗体，Fab或者scFV片段。即把轻重链可变区序列

8、分别与其对