westernblot的原理,流程及常见问题分析.ppt

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1、Westernblot流程和常见问题主要内容一、WesternBlot技术原理与实验流程二、WesternBlot技术常见问题分析23WesternBlot定义WesternBlot又称免疫印迹，主要是通过电泳将样品中的不同蛋白分离开，然后将蛋白样品转移到固相载体上，利用相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。WesternBlot应用目的：检测样品中特异性蛋白质的存在细胞中某种蛋白质的半定量分析蛋白质分子的相互作用研究WesternBlot实验流程4Step4转膜Step6免疫反应Step7检测Step2蛋白定量Step3SDS-PAGEStep1蛋白提取Step5封闭确定

2、蛋白位置，选择合适的蛋白抽提试剂防止蛋白质的降解冰上操作加入蛋白酶抑制剂Bac-细菌蛋白抽提试剂Mam-哺乳动物蛋白抽提试剂Yea-酵母蛋白抽提试剂Tis-组织蛋白抽提试剂Nc-细胞核/浆蛋白抽提试剂步骤一、蛋白提取56步骤二、蛋白定量Bradford检测范围：100-1,500ug/mlBCA检测范围：20-2,000ug/mlLowry检测范围：1－1500ug/ml7BCA定量在562nm处有高的光吸收值，颜色的深浅与蛋白浓度呈正比。绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。梯度稀释步骤三、SDS-PAGE电泳8上样前煮沸样品上样量：30-100μg蛋白Marker9步骤

3、四、转膜3膜的选择：NC、PVDF、尼龙膜转膜方法：半干转、湿转转膜确认：立春红染色、蛋白预染Marker膜的选择1011转移方法半干转用滤纸吸Buffer来做转移体系适合转移小分子量的蛋白；半干转的电流大小是按照面积来算的，时间是根据蛋白分子大小定的；56mA/膜1h湿转将膜、胶、滤纸全浸泡在Buffer的Tank里适合转移大分子量（100KD以上）蛋白；湿转电流是恒定的，时间也是根据分子量而定；300mA1h转移操作12+阳极-阴极多孔垫片滤纸凝胶膜滤纸垫片2层滤纸膜（左上角标记）凝胶（Marker靠左）2层滤纸垫片黑色夹板（负极）56mA/膜1h300mA1h白色夹

4、板（正极）13转膜后确认丽春红可逆染色，检测转膜效率。与下游WB检测完全兼容，无任何干扰。蛋白预染Marker实时监测分子量参照与目的蛋白同时转移至印迹膜上，检测转膜效率。对转膜后的凝胶进行考染丽春红染色结果14步骤五、封闭去除非特异结合位点：BlockingBuffer：3%BSA5%MilkRoomTemperature1h一抗的选择：确定所研究的目的蛋白，根据目的蛋白名称查询相关抗体。抗体所检测的种属：人、小鼠、大鼠等注意：抗体的稀释倍数是由底物和目的蛋白质的丰度决定的，为了获得最佳实验结果，强烈推荐进行预实验，以确定具体的实验参数.步骤六、抗体孵育1516步骤六、

5、抗体孵育二抗的选择：抗小鼠抗兔抗大鼠抗人抗山羊抗鸡抗豚鼠抗马标记物HRP、AP、Biotin、荧光标记、无标记荧光标记抗体红色Cy3、TRITC、RRX、TexasRedX、Dylight549、Dylight594、Dylight649绿色FITC、Cy2、Dylight488蓝色AMCA近红外线Cy5根据一抗物种：根据标记物：步骤七、检测方法17化学发光法：HRP酶标系统----ECL鲁米诺（Luminol）特点：无毒害、灵敏度高、速度快；特异性好、节省抗体、线性宽；可重新剥离检测。化学显色法：酶标系统HRP----TMB和DAB酶标系统AP-----BCIP和NBT

6、特点：方便、便宜；具有一定毒性、灵敏度较低、反应速度慢；检测后的膜不可重新剥离检测。18推荐对照设置内参对照beta-actin/beta-tubulin/GAPDH阳性对照检测一抗是否正常阴性对照检测一抗特异性空白对照不加一抗，只加二抗，检测二抗是否发生交叉反应。二WesternBlot技术常见问题分析19高背景原因解决办法膜的污染使用干净镊子；戴手套操作；换一张新膜用足够的液体，膜始终保持湿润；孵育时使用脱色摇床；避免膜重叠，互相覆盖；小心操作，勿毁损膜漂洗不完全增加漂洗时间和缓冲液体积封闭液不适合比较尝试不同封闭液封闭不完全延长封闭时间（可4℃过夜）抗体浓度过高优化

7、降低一抗、二抗浓度曝光时间过长缩短曝光时间缓冲液污染使用新配制缓冲液信号弱或无信号原因解决办法抗原量不足增加上样量蛋白质储存过程中降解重新制备样品转膜不完全确定转膜效率、保证胶与膜充分结合、电极正确装配、控制转膜温度（冰袋降温）、优化转膜电流及时间。膜错误选择选择合适膜的孔径：>22kD蛋白选用0.45μm孔径<22kD蛋白选用0.22μm孔径抗原被封闭液遮蔽优化封闭液、缩短封闭时间、减小封闭液中蛋白浓度。抗体增加抗体浓度、注意抗体储存条件（避免反复冻融）。曝光时间过短延长曝光时间底物延长底物孵育时间其他现象原因解决办法荧光萃