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时间:2020-03-19
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1、制备小鼠骨髓来源巨噬细胞一、材料1.6-9周小鼠(GFP+小鼠、野生型小鼠)2.配制培养液:RPMI1640培养液+1×GlutaMax(Gibco)+10%FBS(热失活)3.盐溶液:0.9%氯化钠溶液(无菌),储存于4度。4.纯化的重组M-CSF(CSF-1):到货后灭菌PCR管分装。5.消毒后的手术器械。6.70%乙醇溶液。7.27G针头8.20ml注射器9.低绒纸巾10.100mm培养皿11.3个50ml离心管二、方法1.复温培养液(预添加M-CSF)至37摄氏度。2.处死小鼠,喷洒70%乙醇溶液消毒。拉扯双侧后腿直至听
2、到清脆响声(提示股骨从髋骨脱臼)。3.使用干净的剪刀、镊子沿一侧大腿环形剪开皮肤,向爪子方向剥离皮肤。4.用镊子将腿部肌肉分开,露出股骨和胫骨(注意不要损伤骨头)。5.切断股骨与髋骨间的韧带,切下膝关节以下的骨头。将股骨和胫骨至于冰冷的盐溶液中。6.同法处理另一只腿。7.用低绒纸巾小心剥除骨骼上附着的组织,将骨头置入70%乙醇溶液中。8.20ml无菌注射器吸满预热的培养液(无添加M-CSF),装上27G针头。并准备好50ml离心管。9.从膝关节处分离股骨和胫骨,丢弃膝盖骨。一个无菌镊夹住股骨,用一把无菌剪刀剪掉股骨上端。将针头插
3、入骨髓腔,用培养液反复冲洗,将骨髓冲入50ml离心管。冲洗过程中,上下移动针头刮扫骨髓腔。每根骨头使用大约5ml培养液。丢弃骨头。10.同法处理胫骨(剪掉上下两端)。11.将细胞悬液离心(150g,5分钟)。丢弃上清,加入培养液(添加M-CSF)。混匀细胞悬液。12.每根骨头准备两个100mm培养皿。将细胞悬液打入培养皿,添加预热培养液(添加M-CSF)至10ml。13.置于37摄氏度、5%二氧化碳培养箱内培养5天。14.第5天,使用室温盐溶液5ml冲洗培养皿(巨噬细胞为贴壁生长)。使用细胞刮刀刮下贴壁细胞,转移入离心管,150
4、g离心5分钟。分离的细胞建议2天内使用。关于M-CSF的工作浓度:介于1ng/ml到1ug/ml之间。设定浓度梯度培养:如1ng/ml10ng/ml100ng/ml1ug/ml,或倍比稀释。按上述方法培养5日后,细胞计数5×107/培养皿为最合适M-CSF工作浓度。
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