蛋白-脂质体复合物毛细管电泳筛选单胺氧化酶抑制剂.pdf

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1、第4O卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第9期2012年9月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1336—1340蛋白一脂质体复合物毛细管电泳筛选单胺氧化酶抑制剂李冰l，吕雪飞庆宏邓玉林(北京理工大学生命学院，北京100081)(邢台学院生物化学系，邢台054001)摘要基于酶与底物间的相互作用，建立了蛋白一脂质体复合物毛细管电泳筛选单胺氧化酶(MAO)抑制剂的新方法。分别将不同浓度的4种N_炔丙基胺类化合物添加至含有蛋白一脂质体复合物的毛细管电泳缓冲液

2、中，抑制MAO活性。考察MAO底物犬尿胺(Kyn)在含有不同浓度N一炔丙基胺类化合物缓冲液中的迁移时间比率(RMTR)。结果表明，化合物炔丙基甲基一R一庚胺(R一2-HMP)和炔丙基一R一2_庚胺(R一2-HPA)能够明显抑制MAO活性，导致MAO与Kyn的相互作用减弱，Kyn的RMTR值随着R一2-HMP和R2_HPA的增加呈现出明显增加的趋势。化合物N，N_二炔丙基一R2_己胺和N，N一二炔丙基一R一辛胺对MAO活性抑制不明显，Kyn的RMTR随这两种浓度增加变化不大。此结果与柱外孵育测定化合

3、物活性结果一致。与传统MAO筛选剂筛选方法相比，本方法快速，成本低，酶消耗量少且不受分离电压等干扰因素的影响。关键词脂质体；毛细管电泳；单胺氧化酶；抑制剂；相互作用1引言单胺氧化酶(Monoamineoxidase，MAO)是帕金森病药物治疗的重要靶点之一f1_。许多研究表明，MAO抑制剂能够有效降低脑内多巴胺代谢，减缓PD症状，同时具有神经保护作用嘲。因此MAO抑制剂的筛选已受到广泛关注。传统的MAO抑制剂筛选方法主要包括高效液相色谱法(HPLC)，放射化学法和荧光检测法等。HPLC和放射化学法

4、成本高，较为耗时。荧光检测法灵敏度高，但容易受溶液中非目标分子的干扰。毛细管电泳具有分辨率高，分析速度快，高通量，低消耗等优点，已被广泛用于分子间相互作用研究和抑制剂筛选工作】。脂质体作为理想天然的生物膜模型，被广泛用于毛细管电泳的假固定相来分离蛋白、手性分子以及模拟药物一生物膜相互作用no。本研究将蛋白与脂质体重组形成蛋白一脂质体复合物模拟膜蛋白MAO与底物犬尿胺(Kyn)间的相互作用。基于酶与底物间的相互作用进行MAO抑制剂筛选。本方法成本低，同时采用双内标体系，能够准确反映分子问相互作用的大

5、小，干扰因素少。2实验部分2．1仪器与试剂HPCE毛细管电泳仪(Agilent公司)；石英毛细管(有效长度40crn,总长48．5cm,375m(o．d．)，50um(i．d．)，河北永年锐沣色谱器件有限公司)；超声破碎仪(美国Sonics&Materials公司)；Biofuge22R高速离心机(德国Heraeus公司)。犬尿胺(Kyn)、大豆卵磷脂(Sigma公司)；胆固醇(北京双旋微生物培养基制品厂)；二甲基亚砜(DMSO，Amersco公司)；苄基三乙基氯化铵(TEBA，北京化学试剂公司)

6、；N一炔丙基一N一甲基一R一2一庚胺(R一2一HMP，化合物1)，N一炔丙基一R一2一庚胺(R一2一HPA，化合物2)，N，N一二炔丙基一R一2_己胺(化合物3)，N，N一二炔丙基一R一辛胺(化合物4)，均由加拿大Saskatchewan大学提供。4种化合物结构见图1。2．2实验方法2．2．1脂质体制备大豆卵磷脂与胆固醇以质量比3：1混合溶解于正己烷中，将溶液置于圆底烧瓶中，于50℃水浴进行旋转蒸发，待正己烷完全挥发，瓶底形成一层淡黄色薄膜即停止。向其中加入适量2011—10-07收稿；2012-

7、01—23接受本文系国家自然科学基金(No．20905007)，教育部新世纪优秀人才支持计划(No．NCET一08-0048)和国家重点基础研究发展规划(No．2009BAK59B01)资助项目E—mail：deng@bit．edu．cn第9期李冰等：蛋白一脂质体复合物毛细管电泳筛选单胺氧化酶抑制剂IICH3，_-(C

8、HI2)-CH-N,~：一一一kA-I3CH，，一(cHH)-CH一N：茎二喜⋯CH3-(C4H2)5一cH—N<⋯二三一⋯‘3Fig．1StructuresofN—proparg

9、ylaminecompounds10mmol／LTris—HCI缓冲液(pH7．4)，在超声发生器上进行水浴超声，使薄膜均匀水化形成脂质体乳液。调整磷脂浓度为4g／L。2．2．2MAO制备MAO的制备参考文献f13]。将Wistar大鼠鼠脑置于10mmol／LTris—HC1缓冲液(pH7．4)中进行匀浆。将匀浆后的悬浊液以1000×g离心30min，取上清液；再以17000×g下离心30min，取沉淀；将沉淀重新悬浮于10mmol／LTris—HCI缓冲液(pH7．4)中，此步骤