靶向亲和-液质联用技术对人参茎叶总皂苷中α-葡萄糖苷酶抑制剂的快速筛选.pdf

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1、第41卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第11期2013年l1月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1694—1698DOI：10．3724／SP．J．1096．2013．30532靶向亲和．液质联用技术对人参茎叶总皂苷中．葡萄糖苷酶抑制剂的快速筛选何忠梅王晓慧李国峰孙佳明杨鹤郜玉钢张连学(吉林农业大学人参工程技术创新中心，长春130118)(长春中医药大学第一附属医院，长春130117)(长春中医药大学中医药与生物工程研究开发中心，长春130117)摘要建立了用于快速筛选人参茎叶总皂苷中一葡萄糖苷酶抑制剂的靶向亲和一

2、液相色谱一质谱联用技术(Targetmoleculeaffinity—LC．ESI—MS)。从人参茎叶总皂苷中筛选并鉴定出了人参皂苷Rb等12种具有潜在仪一葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，同时对其中5种化合物(包括人参皂苷F：，Rf，Rg，，Rd和Rb。)进行了活性验证，发现人参皂苷Rb活性最强，对一葡萄糖苷酶活性抑制率为43．16％，抑制作用接近总皂苷。本方法直接从复杂的中药提取物中筛选出具有抑制一葡萄糖苷酶的滑眭成分，简单、快速、准确，适用于实现复杂体系中01一葡萄糖苷酶抑制剂的高通量筛选。关键词靶向亲和一液质联用技术；人参茎叶总皂苷；一葡萄糖苷酶抑制剂1引言餐

3、后高血糖是Ⅱ型糖尿病患者的重要症状。研究发现，Od一葡萄糖苷酶抑制剂能有效防治餐后高血糖，可用于治疗Ⅱ型糖尿病j。一葡萄糖苷酶抑制剂通过可逆占据一葡萄糖苷酶与糖的络合位点，抑制Ot一葡萄糖苷酶催化多糖降解为单糖，进而抑制餐后高血糖。尽管合成的Ot一葡萄糖苷酶抑制药物(如拜糖平)已经在临床广泛使用，但由于它们具有一定的毒副作用J，所以，广大学者开始从药用植物中筛选天然的一葡萄糖苷酶抑制剂，以期寻找到更安全、更有效的药物。人参是我国传统名贵中药，其主要活性成分人参皂苷在人参茎叶中含量最高。徐玉林等以人参茎叶提取物为原料制备的5种稀有人参皂苷对一葡萄糖苷酶表现出一定的

4、抑制活性，且在一定程度上趋近于拜糖平。靶向亲和技术主要是利用亲和原理，将具有潜在活性的小分子化合物混合物与受体混合，得到受体一配体复合物和未结合的小分子，通过超滤薄膜将未结合的小分子滤除后，复合物可以用有机溶剂处理，将小分子配体释放出来，采用LC—MS联用技术对这些活性分子进行分离和鉴别。该方法已广泛应用于筛选与靶蛋白相结合的药物配体，vanBreeman课题组利用该方法从化合物库或中药提取物中筛选了许多靶蛋白(如：DHFR，COX．2，ER．，ER一0【)的药物配体l5J。本研究采用靶向亲和一液相色谱．质谱联用技术(Targetmoleculeaffinity

5、—LC．ESI—MS)对人参茎叶总皂苷中的Ot一葡萄糖苷酶抑制剂进行快速筛选。2实验部分2．1仪器与试药Agilent1100se~esLC-MSD液相色谱一质谱联用仪(美国Agilent公司)，包括：AgilentSL型多级离子阱质谱仪、低压四元梯度泵、二极管阵列检测器(DAD)、自动进样、柱温箱、Chemistation化学工作站等；BP211D型十万分之一电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)。自动酶标仪(Bio—Rad)；XL90超速离心机(Beckman)；旋转式恒温振荡器(苏州培英实验设备有限公司)。人参茎叶总皂苷(吉林省宏久生物科技股份有限公司(紫外

6、检测分析总皂苷含量为81．7％))；人参皂苷F：，，Rg。，Rd和Rb购于中国药品生物制品检定所。一葡萄糖苷酶(来源于酵母)购自Fluka公司；葡萄糖测定试剂盒(上海荣盛生物技术有限公司)；YM一100超滤膜(Millipore公司)；96孔板(美国Coming2013-06-02收稿；2013-08—18接受本文系国家自然科学基金项目(No．31070316)、国家科技支撑计划项目(No．2011BA103B010602)、吉林省科技条件与平台建设计划(No．20112101)和国家科技重大专项子课题(N0．2012zX(】93O4006)资助E—mail：4

7、35398002@qq．conl第11期何忠梅等：靶向亲和一液质联用技术对人参茎叶总皂苷中O／一葡萄糖苷酶抑制剂的快速筛选公司)；乙腈、甲醇和甲酸均为色谱纯(美国Fisher公司)；水为娃哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯。2．2样品制备称取8．0mg人参茎叶总皂苷样品于锥形瓶中，加入400txL的二甲亚砜(DMSO)溶解，用1600IxL去离子水稀释至溶液浓度为20％DMSO溶液，过0．45m滤膜，样品用于超滤实验和活性实验分析。称取1．0mg人参茎叶总皂苷样品于锥形瓶中，加入1．0mL甲醇溶解，过0．45m滤膜，样品用于液相色谱一质谱联用分析。人参皂苷F，Rf，

8、Rg，Rd和Rb，标准品