RT-qPCR(实时荧光定量PCR).ppt

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1、实时荧光定量PCR技术RealTimeQuantitativePCR南开大学医学院lfnnLogoRT-qPCR原理Contents1RT-qPCR步骤2SYBR实验步骤3LogoRT-qPCR原理1定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最后通过通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析的方法。1.荧光原理：SYBRGreen2.定量原理：（1）介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值（2）定量原理：绝对定量（标准曲线）、相对定量（2-Δ

2、ΔCt）（3）融解曲线非特异性荧光标记：1、SYBRGreen结合于双链DNA小沟之间，只有和双链DNA结合后才发荧光。（在变性过程中无荧光，在复性及延伸过程中发出荧光）RT-qPCR原理---荧光原理特异性荧光标记：1、TaqMan水解型杂交探针。5′端标记有报告基团R，3′端标记有荧光淬灭基团Q。探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光。Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针R与Q分开，发出荧光。2、MolecularBeacon分子信标。标记荧光的发夹探针，环与目标序列互补，茎由互补配对序列组成

3、。变性过程：产生非特异性荧光；延伸过程：不产生荧光；退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号。3、Amplisensor双链信号引物，进行半巢式扩增；随着PCR循环的重复进行，信号引物的双链结构被破坏，其中一条链参与到产物的合成中，荧光消失，产物量与荧光成反比。QQRLogoRT-qPCR原理----定量原理1扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。Ct值极具重现性。分析定量时多取1

4、5-35较好。荧光信号阈值（threshold）：前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值。荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。LogoRT-qPCR原理----定量原理1理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0(1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率logX0=-log(1+Ex)*Ct+logXLog浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算

5、出样品中所含的模板量.1.绝对定量LogoRT-qPCR原理----绝对定量1模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量1.绝对定量LogoRT-qPCR原理----绝对定量1R2为相关系数：R2>0.99时，认为两数值之间相关性好。E为扩增效率：一般认为在90%-110%之间数据可用。LogoRT-qPCR原理----相对定量12.相对定量病人内参基因病人目的基因对照内参基因对照目的基

6、因Ctabcd结果表示病人的目的基因的表达是对照组目的基因表达的多少倍。RT-qPCR原理----融解曲线温度荧光强度TmTm值：DNA解链一半时的温度将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)融解曲线为单一峰，无非特异性荧光，定量准确。溶解峰反映反应中扩增到的产物的量。前面杂峰较多时可能原因为样品未混匀。RT-qPCR步骤----SYBRGreen法1.准备物品：检测样本、内参、引物、荧光染料、八连管、移液枪、Realplex软件2.将样本等稍许离心3.加样（可将所有共同物质加入同一管中，混匀后分散入其他管中）反

7、应体系：ddH2O10μL染料8μL引物上下游各0.5μL样本1μL4.将八连管标记后离心至无壁挂液体5.将其置入Realplex仪中，设置程序：95℃15s95℃15s57℃30s74℃30s45循环，END后右键设置“insert---meltingcurve”，后绿色运行6、反应结束后将数据导出，分析数据。反应体系的建立及优化:SYBRGreen使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准MgCl2（多聚酶的激活剂）浓度:可以降低到1.5mM

8、,以减少非特异性产物反应Buffer体系的优化反应温度和时间参数:由酶和引物决定其他与常规PCR相同RT-qPCR步骤----SYBRGreen法对DNA模板没有选择性----适用于任何DNA使用方便-----不必设计复杂探针非常灵敏便宜优点容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性，但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件对引物特异性要求较高缺点