DB34∕T 1435-2011 抗虫玉米MON810及其衍生品种 实时荧光PCR检测方法.pdf

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1、ICS65.020.20B22DB34安徽省地方标准DB34/T1435—2011抗虫玉米MON810及其衍生品种实时荧光PCR检测方法Real-timePCRmethodforinsect-resistantmaizeMON810anditsderivates2011-05-11发布2011-06-11实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T1435—2011前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省技术监督局提出。本标准由安徽省质量技术监督局归口。本标准起草单位：安徽省农业科学院水稻研究所和安徽省标准化研究院。本标准主要

2、起草人：马卉、汪秀峰、杨剑波、李莉、张士胜、陆徐忠、倪大虎、宋丰顺、张毅、陈萍、倪金龙、杨亚春。IDB34/T1435—2011抗虫玉米MON810及其衍生品种实时荧光PCR检测方法1范围本标准规定了转基因抗虫玉米MON810的实时荧光PCR转化体特异性检测方法。本标准适用于转基因抗虫玉米MON810及其衍生品种，以及相关制品中MON810成分的实时荧光PCR定性检测方法。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/

3、T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求和定义NY/T673转基因植物及其产品检测抽样NY/T674转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化农业部869号公告-9-2007抗虫玉米MON810及其衍生品种定性PCR方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1基因zSSIIbzSSIIbgene玉米醇溶蛋白基因。3.2MON810转化体特异性序列event-specificsequenceofMON810外源插入载体3’端与玉米基因组的连接区序列，包括外源基因cry1Ab部分序列和玉米基因组部分序列。3.3

4、实时荧光PCRReal-timePCR通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量的分析。3.4阈值threshold1DB34/T1435—2011实时荧光PCR中以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。3.5Ct值cyclethreshold每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。4原理实时荧光PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监控整个PCR过程。TaqMan荧光PCR技术是以TaqMan荧

5、光探针为基础，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。根据玉米内标准基因zSSIIb和MON810转化体特异性序列，分别设计引物和探针进行PCR扩增，建立玉米内标准基因zSSIIb和MON810转化体实时

6、荧光PCR检测方法，根据检测结果判断试样中是否含有转基因成分MON810。5试剂与材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。5.1琼脂糖。5.270％乙醇（V/V）。5.310mg/mLRNaseA：将胰RNA酶（RNaseA）溶于10mmol/LTris-HCl(pH7.5)、15mmol/LNaCl中，配成10mg/mL的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。5.410mol/LNaOH溶液:在160mL水中加入80.0g氢氧化钠（NaOH），溶解后再加水定容到200mL。

7、5.5500mmol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8.0):称取乙二铵四乙酸二钠(EDTA-Na2)18.6g，加入70mL水中，再加入10mol/LNaOH溶液，加热溶解后，冷却至室温，再用10mol/LNaOH溶液调pH至8.0，加水定容到100mL，在103.4kPa(121℃)灭菌20min。5.6TE缓冲液（pH8.0):1mol/LTris-HCl（pH8.0）10mL和500mmol/LEDTA（pH8.0）溶液2mL，用水定容至1000mL。5.7dNTPs混合溶液:将浓度为10mmol/L的dATP，dCTP，dGTP，dTTP四种

8、脱氧核糖核苷酸等体积混合。5.8适用于PCR反应的TaqDNA聚合酶（5U/μL）及其反应缓冲液。5.9引物