荧光定量PCR原理及实验步骤.doc

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1、荧光定量PCR原理及实验步骤一、实时荧光定量PCR原理常规PCR技术对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。实时定量PCR技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。几个概念：（1）扩增曲线：（2）荧光阈值：（3）Ct值：（1）标准曲线SYBRGreen工作原理：1、SYBRGreen 能结合到双链DNA的小沟部位2、SYBRGreen 只有和双链DNA结合后才发荧光3、变性时，DNA双链

2、分开，无荧光4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreen发荧光，在此阶段采集荧光信号。二、实验步骤1.实验前先在大型仪器共享平台上预约多元荧光定量PCR仪。1、将所需引物和SYBgreen（避光）拿出，解冻。计算好所有引物和SYBgreen的用量。2、反应体系（25μL）如下：H2O11μLSYBgreen12.5Μl上游引物0.25μL下游引物0.25μLcDNA1μL可先将H2O和SYBgreen按照所需量配好后，分装，再根据需要加引物和模板。4、加完所有试剂后，盖上盖子，混匀，离心。上机。