植物组织中过氧化氢酶活性测定.doc

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1、植物组织中过氧化氢酶活性测定植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除H2O2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物组织中H2O2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。本实验用紫外吸收法测定过氧化氢酶活性。过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法【原理】H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应

2、时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。【仪器与用具】   紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶1个；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml试管3支；恒温水浴；【试剂】0.2mol/LpH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；0.1mol/LH2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。   【方法】   1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量

3、瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。2.测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表40-2顺序加入试剂。表40-2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表管 号S1S2S3粗酶液(ml)0.20.20.2pH7.8磷酸(ml)1.51.51.5蒸馏水(ml)1.01.01.0   25℃预热后,逐管加入0.3ml0.1mol/L的H2

4、O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。   3.结果计算：   以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。     过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=式中 A240=AS0－         AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值；         AS1,AS2—样品管吸光值；         Vt—粗酶提取液总体积（ml）；         V1—测定用粗酶液体积（ml）；

5、         FW—样品鲜重（g）；         0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）；         t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。   【注意事项】    凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。【思考题】   1.影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些?2.过氧化氢酶与哪些生化过程有关?