植物组织石蜡切片的制备与染色观察.doc

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1、植物组织石蜡切片的制备与染色观察一．实验器具与试剂1.器具小培养皿、锡箔纸、尖头和平头镊子、剪刀、刀片、吸水纸、移液枪、1ml枪头、移液器和移液管、量筒（50mL，100mL，250mL，500mL）、废液瓶、水浴锅、酒精灯、三角瓶、真空锅、烘片箱、木筷、石蜡切片机、染色缸、载玻片、盖玻片、显微镜等2.试剂100%酒精、100%二甲苯、100%叔丁醇、石蜡块、蒸馏水、多聚甲醛、中性树胶、甲苯胺蓝（TB）染色剂等二.实验步骤1.溶液配制10×PBS溶液：NaCl（国药或生工）75.95gNa2HPO4.12H2O（国药）25.07gNaH2PO4.2H2O（国药）4.68g充分溶解后

2、，用NaOH（国药）调PH7.0，定容1000mL，高压灭菌25min，4℃保存。4%多聚甲醛固定液：1×PBS100mL1M/LNaOH0.5mL水浴加热至60-70℃，在通风橱中加入4g多聚甲醛，待溶解后冷却至4℃，加入100µl的10%的浓硫酸调节pH为7.0。2.材料准备⑴固定取幼嫩的植物材料，将植物组织剪成合适大小的小块，立即放入一个装有新配制的4%多聚甲醛固定液的小器皿中，固定液体积视材料多少而定，一般材料少时10ml材料较多时可放15ml，小器皿置于冰上。上面用锡箔纸盖好后扎孔。抽真空使得材料浸没其中（反复真空和非真空状态，并保固定液不要沸腾），待材料下沉到管底。具体

3、操作如下：①放置在冰上的器皿放入真空锅里，盖上锅盖，拧开盖上螺旋，拧紧侧面螺旋，打开开关当压力表上显示到0.2时可计时10分钟。②关上锅盖螺旋，拧松侧面螺旋，外面空气会进入真空锅内，当内外压力相等时计时10分钟。③再重复步骤①，换一次新的固定液，4℃过夜固定，但不要超过16h。(2)漂洗用1×PBS缓冲液（PH7.0）漂洗组织块2次，每次4℃放置30min。注意PBS容易结晶可75℃水浴加热。(3)脱水在翻转下进行梯度乙醇和叔丁醇脱水：30%、40%、50%、60%、70%乙醇（此步可保存可过夜）、10%叔丁醇+20%水+70%乙醇、20%叔丁醇+10%水+70%乙醇、30%叔丁醇

4、+70%乙醇、50%叔丁醇+50乙醇、70%叔丁醇+30%乙醇、90%叔丁醇+10%乙醇、100%叔丁醇（2次），30min/次。补充：若没有叔丁醇，可替换一下步骤进行30%、40%、50%、60%、70%、80%、95%、100%乙醇，然后1/4二甲苯+3/4乙醇、1/2二甲苯+1/2乙醇、3/4二甲苯+1/4乙醇、100%二甲苯(2次)，每步均30min。(4)浸蜡用刀片将石蜡块切成碎末，逐步加入到上述最后一步的材料中大约是1/4的量，37℃烘箱过夜；继续加石蜡，同时放入到42℃，待石蜡不继续熔化时放入到60℃烘箱中，等待全部融化后，将叔丁醇和石蜡的混合物换成纯蜡，每天上午下午

5、（9点）各换纯蜡一次，持续3天。(5)包埋最后将材料包埋备用。在切片前将包埋块4℃冰箱中保存，可保存至少一年。3.组织切片⑴切片将包埋的材料用切片机进行组织学切片，切成8μm厚度的连续的薄片，用刀片把蜡片切成合适的长度（能放在载玻片上即可）。⑵展片和烘片转入42℃的水中展片2-3min，用氨基载玻片将其捞出，放置于42℃过夜烘片（烘过的片子可以再放干燥剂的条件下保存数周。⑶脱蜡将烘过的片子浸没在100%的二甲苯脱蜡两次，每次15min；⑷复水梯度乙醇复水：100%、95%、85%、70%、60%、30%、水两次，每步3min。⑸染色0.05%TB（甲苯胺蓝）染色37℃,30min。

6、染色时间不要太久，中间可以拿出来看一下。然后把片子置于一个盛水的容器中，把片子浸入再提出，不要直接用水冲，直至水变清，拿出晾干。二甲苯：无水乙醇=1：110s。100%二甲苯2min,2次。滴上1—2滴中性树胶（加拿大树胶）后盖上盖玻片（不要有气泡)。⑹镜检观察。