土壤酶活性测定方法2016.04.20.doc

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1、土壤脲酶（urease）活性的测定方法：靛酚比色法（一）方法原理土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，因而用于脲酶活性的测定。（二）试剂1）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素，加蒸馏水90ml。3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：取184g柠檬酸溶于300ml蒸馏水中，另取147.5gKOH溶于蒸馏水，再将二种溶液合并，用1NNaOH将pH调节至6.7，用水稀释至1L。4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：A．62.5克苯酚溶于少量乙醇，加

2、2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A液），存于冰箱中；B.27克NaOH溶于100毫升水（B液）,存于冰箱中。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将两种溶液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。6）氮的标准溶液：精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000mL，得到1mL含有0.1mg氮的标准液（100ppm）。（三）测定步骤（1）标准曲线绘制吸取配置好的氮溶液10mL，定容至100mL，即为10ppm，吸取0、1

3、、2、3、4、5、10、15、20mL移至50mL容量瓶，加水至20mL，再加入4mL苯酚钠，仔细混合，加入3mL次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。即为0、0.2ppm、0.4ppm、0.6ppm、0.8ppm、1ppm、2ppm、3ppm、4ppm的标准曲线。将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。（2）土壤中脲酶活性的测定称取10g土壤置于100ml容量瓶中。用2mL甲苯处理15分钟。往瓶中加入10mL10%尿素溶液和2

4、0mL柠檬酸缓冲液（pH6.7）。仔细混合后，将瓶放在37℃恒温箱中，放置24h。之后用38℃水定容至100ml（甲苯浮在刻度线上）。与此同时，进行以水代替基质（10ml10%尿素用10ml蒸馏水代替），及无土对照测定。培养结束后，将悬液过滤。吸取3mL（视情况而定）滤液于50mL容量瓶中，用蒸馏水加至10mL。然后按标准曲线绘制的操作加入苯酚钠等试剂，显色，比色，最后根据标准曲线求出氨态氮含量。以每克土壤在37℃下24h内酶解尿素释放的NH3-N的毫克数来表示脲酶活性。过氧化氢酶测定(容量法)1.试剂配制

5、a.0.3％过氧化氢溶液：将10ml30%的过氧化氢用水稀释至1L，此溶液不稳定，需临时配置。b.1.5mol/L硫酸：8.4ml浓硫酸溶于水，再用蒸馏水稀释至100mlc.0.002mol/LKMnO4溶液：称取化学纯高锰酸钾0.3161g，溶于1升蒸馏水中，贮于棕色瓶中，备用。如果知道酶活性很高的话可以适当变化高锰酸钾浓度2.操作步骤（1）取5g过1mm风干土，置于150mL三角瓶中，并注入40mL蒸馏水和5mL0.3％H2O2溶液。（2）同时设置对照，即三角瓶中注入40mL蒸馏水和5mL0.3％过氧化

6、氢溶液，而不加土样。并作无土对照。（3）将三角瓶放在振荡机上振荡（120r/min）30min后，加入5mL1.5mol/L硫酸，以稳定未分解的过氧化氢。再将瓶中悬液用慢速滤纸过滤。吸取25mL滤液，用0.002mol/L高锰酸钾滴定至淡粉红色终点（30s不退色）。3.结果计算以单位土重消耗的0.002mol/L高锰酸钾毫升数（对照与试验测定的差）表示土壤过氧化氢酶活性，其计算式为：土壤过氧化氢酶活性（mlKMnO4/g干土）=(V0-V)/m式中，V0为滴定空白所消耗的高锰酸钾毫升数（ml）V为滴定试样所

7、消耗的高锰酸钾毫升数（ml）；m为烘干土壤重量（g）。高锰酸钾溶液标定：吸取2ml0.1N草酸钠标准液于200ml三角瓶中，并加水至80ml左右，投入几粒玻璃珠，再加5ml1:3的硫酸酸化，在电炉上加热2min，取下稍冷，趁热（70-80度）用高锰酸钾溶液滴定，滴至为红色（30s不退色）即达到终点，记下高锰酸钾的毫升数（V）。高锰酸钾溶液标准浓度按下式计算c（1/5KMnO4）=m/（V1-V2）*0.06700式中：c（1/5KMnO4）—高锰酸钾标准溶液的物质的量浓度，mol/L；m—草酸钠之质量，g；

8、V1—高锰酸钾溶液之用量，mL；V2—空白试验用高锰酸钾溶液之用量，mL；0.06700—与1.00mL高锰酸钾溶液c（1/5KMnO4）=1.000mol/l相当的以克表示的草酸钠的质量。土壤磷酸酶测定方法：磷酸苯二钠比色法磷酸酶(phosphatase)能酶促有机磷化合物的水解。试验表明，土壤微生物对于土壤含磷有机物的矿化起着主要的作用；某些高等植物的根系也有磷酸酶活性。土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力状况