免疫组化步骤.doc

《免疫组化步骤.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、取组织：1.心脏灌注将小鼠在肋弓下缘剪开，夹住胸骨角，向上翻开，暴露胸腹膜，从右向左剪开胸腹膜，暴露心脏，剪开右心耳（在心尖靠右一点）插入针管，先打入10ml水，再注入10%甲醛约10ml，（可重复一次），至肝脏发白，四肢有抽搐为成功。2.取脑取脑后放入4%多聚甲醛中，固定保存24h3.梯度脱水(不是必须步骤，但做的效果可能更好，但标本脱片是否与之有关系？)将脑放入5%蔗糖48h----2.5%蔗糖48h----1%蔗糖48h后放入4%多聚甲醛中，固定保存，制成切片。4.自制蜡块三步法，sp试剂盒，需要摸浓度，还有PBS自己配免疫组

2、化1.常规石蜡切片，石蜡脱水60℃烤片30min脱蜡：二甲苯Ⅰ5min二甲苯Ⅱ10min无水乙醇—95%酒精Ⅰ—95%酒精Ⅱ—80%酒精各5sPBS液洗3次，每次5min2.抗原修复①枸橼酸盐微波修复（冷却与小火之间）13min室温冷却至常温②枸橼酸盐微波修复（冷却与小火之间）2x10min（10min后加少许冷枸橼酸）室温冷却至常温（此步作为①未作出时的办法，最大可以尝试到3x10min）③枸橼酸盐微波修复（高火）4x6min室温冷却至常温（此步作为①②均未作出时的办法）3.3%H2O210min（买30%的回来自己稀释）PBS液

3、洗3次，每次3min4.封闭用正常山羊血清工作液室温孵育20min5.一抗4℃过夜，第二天将过夜片放入37℃温箱孵育1hPBS液洗3次，每次3min6.生物素化二抗工作液37℃温箱孵育30minPBS液洗3次，每次3min7.辣根酶标记链霉卵白素工作液37℃温箱孵育30minPBS液洗3次，每次3min8.DAB显色（此步最重要，一定要摸出最佳显色时间，要浪费三张片子，一张显过了，一张未显出来，一张介于二者之间）9.自来水终止显色10.苏木素染色2min，自来水冲洗（8次以上，不能怕麻烦），盐酸酒精分化，自来水冲洗（6次以上），PB

4、S返蓝20min（PBS要预热15min）11.脱水，透明（80%酒精—95%酒精Ⅱ—95%酒精Ⅰ—无水乙醇—二甲苯Ⅱ—二甲苯Ⅰ各5秒，就是将脱蜡反过来了）4.树胶封片（就滴很少，用手按压可以顺便将气泡压出，滴多了，树胶容易翻上盖玻片，那就麻烦了）注：95%酒精Ⅱ95%酒精Ⅰ二甲苯Ⅱ二甲苯Ⅰ都有卖的PBS自己配很划算（下页是配制方法）A液：0.1mol/L磷酸二氢钾：磷酸二氢钾（KH2PO4，MW136.09）1.361g，加双蒸水至100ml。B液：0.1mol/L磷酸氢二钠：酸酸氢二钠（Na2HPO4.2H2O，MW177.99

5、）1.78g，加双蒸水至100ml。或者酸酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O，MW358.14）3.58g，加双蒸水至100ml。pH－－A液（ml）－－B液（ml）5.60－－9.50－－0.255.91－－9.00－－1.006.24－－8.00－－2.006.47－－7.00－－3.006.64－－6.00－－4.006.81－－5.00－－5.006.98－－4.00－－6.007.17－－3.00－－7.007.38－－2.00－－8.007.73－－1.00－－9.008.04－－0.50－－9.50一般免疫组化用PB

6、S都只包含Na2HPO4•12H2O（磷酸氢二钠）NaH2PO4•2H2O（磷酸二氢钠）Nacl用于细胞培养的PBS需含有氯化钾称取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可0.01MPBS缓冲液称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4•12H2O 3.63g, KH2PO4 0.24g，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L，常温保存备用。PBS是最普遍不过的实验室缓冲液，但

7、其配方各异。以下是我的总结： 母液的配制： 0.2M Na2HPO4：称取 71.6g Na2HPO4-12H2O，溶于 1000ml 水0.2M NaH2PO4：称取 31.2g NaH2PO4-2H2O，溶于1000ml 水各种浓度PB(pH=7.4)的配制：先配 0.2M PB (pH=7.4，100ml)：取19ml 0.2mol/L的 NaH2PO4， 81ml 0.2mol/L 的 Na2HPO4, 即可。然后 只需将0.2M PB (pH=7.4)按相应比例适当稀释 即可，如：0.1M PB（PH=7.4） ：取 50

8、0ml 0.2M PB，加水稀释至 1000ml 即可。0.01M PB （PH=7.4）：取50ml 0.2M PB，加水稀释至 1000ml 即可。0.02M PB （PH=7.4）：取100ml 0.2 M PB，加水稀释至 1