基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法检测罕见单糖合成酶.pdf

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1、第41卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报第1期2013年1月ChineseJournalofAnalyticalChemistryl15一l18I)131：10．3724／SP．J．1096．2013．20427基质辅助激光解吸电离．飞行时间质谱法检测罕见单糖合成酶周大炜刘斌2吴俊丽2齐源远(南开大学泰达生物技术学院，天津300457)(天津市微生物功能基因组学重点实验室，天津300457)(南开大学分子微生物学与技术教育部重点实验室，天津300457)摘要以VioF(普罗威登斯菌030中O抗原基因簇内

2、)编码的甲酰基转移酶酶促反应产物为研究对象，采用碰撞诱导解离(CID)负离子模式基质辅助激光解吸电离一飞行时间质谱(MALDI—TOFMS)技术建立简单、高效的罕见单糖合成酶监测方法。本方法首先直接质谱分析0．3未经色谱分离、除盐处理的酶促反应混合物，随后应用CID串联质谱技术对酶活反应产物进行结构表征，实现酶活反应的快速监测。结果表明：高能CIDMALDI．TOF／TOF．MS平台适用于新建克隆的单糖合成酶酶活反应的监测，与现有的监测方法相比，在速度、灵敏度、重现性、自动化和溶剂消耗方面具有绝对优势。关键词罕见

3、单糖；单糖合成酶；基质辅助激光解吸离子化一飞行时间质谱1引言随着越来越多的细菌表面多糖抗原的结构得到鉴定，被发现的罕见单糖成分逐渐增多，表明罕见单糖在O抗原多样性的形成中占有非常重要的地位。如．鼠李糖对于某些细菌的毒性是必须的，该合成路径并未在人类中发现。由于含有罕见单糖的抗原结构更容易逃避宿主细胞的免疫识别，因此在细菌尤其是致病菌的形成和进化过程中，罕见单糖起着非常关键的作用。通过对O抗原中罕见单糖合成酶基因的研究，将增加对O抗原多样性及其形成和进化机理的了解。基质辅助激光解吸电离．飞行时间质谱(MALDI—T

4、OFMS)可测定完整的罕见单糖分子质量，同时还可以应用碰撞诱导解离(CID)技术获得罕见核苷糖的骨架等信息。特别是MALDI．TOFMS技术已成功用于多种酶的活性监测。因此，结合已知罕见核苷糖生化合成途径的专业知识，可以胜任罕见单糖合成酶酶活的监测和初步表征工作。本研究以本实验室前期应用核磁共振(NMR)技术已证明其基因功能的VioF编码的转甲酰基酶酶促反应产物为研究对象(示意图1)】，采用MALDI．TOFMS技术监测酶活产物的生成，并在进一步应用高能CIDMALDI．TOF／TOF—MS技术对VioF酶促反应

5、产物的结构进行表征的基础上，建立了简单、高效、灵敏和准确的罕见单糖合成酶活性监测方法。本研究为酶法合成罕见单糖奠定了基础。2实验部分2．1仪器与试剂MALDI—TOFMS基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(4700AppliedBiosystems，MA)。甲醇、乙腈(色谱纯，Fisher公司)；O／一氰基4一羟基肉桂酸(Ot-CHCA，Fluka公司)；Od．D一葡萄糖．1．磷酸盐(Glc．1一P)，脱氧胸苷三磷酸(dTTP)，5一磷酸吡哆醛(PLP)，无机焦磷酸脂酶(Inorganicpyrophosphat

6、ase)，谷氨酸钠(L—Glu)，N一5甲酰基四氢叶酸(Ⅳ一5一FnIF)，一巯基乙醇(2-Mercaptoethano1)，2一[4一(羟乙基)一1一哌嗪基]乙磺酸(HEPES)和二硫苏糖醇(DTT)，均购自Sigma—Aldrich；大肠杆菌O7中rmlA基因，rmlB基因、VioA基因和普罗威登斯菌030抗原中VioF基因的克隆、含相应重组质粒的细菌培养及上述4个表达产物的纯化制备等按文献[1]方法进行。实验用水为二次蒸馏水。2012-04-22收稿；2012-08—16接受本文系南开大学引进人才科研启动资

7、金(No．J02006)资助E—mail：daweizhou@nankai．edu．cnl16分析化学第41卷H20CH,OHCH2OH““nuaiiJl-a。葡萄糖Gl。l。磷酸盐胸苷．．J。a-D-c-

8、-p一：磷酸葡萄糖胸苻，一瞵酗6．脱氧．水糖．六4u毗啶糖’ct-ketoCHCH3]一H~k-ff~＼NH2∞一一胸营=哮二鬻脱氧_D一葡繇萄糖·脚廿二竺一嫠脱氧一匍黥锎穗鞋示意图1胸苷二磷酸一D4一甲酰氨基-4，6一二脱氧一D一葡萄糖(dTDP—D—Qui4NFo)的生物合成途径⋯Scheme1Pathw

9、ayforthebiosynthesisofdeoxythymidine—diphosphate-4，6-dideoxy-4一formamido一5一glucose(dTDPD—Qui4NFo)2．2dTDP-D—Qui4N和Ⅳ-1O甲酰基四氢叶酸(Ⅳ-10-FTHF)的制备三酶(RmlA，RmlB和VioA)偶联酶促反应体系的组成：8mmol／LGlc一1一P’8mmo