《酶分子修饰》PPT课件.ppt

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1、上节课主要内容回顾从酶的生产到酶的改性酶分子修饰所要解决的问题和修饰的目标酶分子修饰的种类侧链基团修饰酶的改性（enzymicimproving）：通过各种方法使酶的催化特性得以改进的技术过程。酶改性的技术酶分子的修饰酶固定化酶的非水相催化酶的定向进化……酶分子修饰通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。4.1概述2、酶分子修饰的原因细胞外稳定性差；酶活性不够高；具有抗原性。4.1概述4、酶分子修饰的目的研究酶的结构与功能的关系。人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围。（70年代末之后）提高酶的生物活

2、性（酶活力）。增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。产生新的催化能力。4.4酶分子的修饰方法金属离子置换修饰大分子结合修饰侧链基团修饰肽链有限水解修饰氨基酸置换修饰酶分子的物理修饰氨基酸侧链基团修饰剂Lys（赖）氨基三硝基苯磺酸，2,4-二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸Asp、Glu（天冬、谷）羧基碳化二亚胺Arg（精）胍基苯乙二醛，1,2－环己二酮、丁二酮Cys（半胱）巯基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺二硫键巯基乙醇、DTT（二硫苏糖醇）His（组）咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr（酪）

3、酚羟基碘、四硝基甲烷Trp（色）吲哚基N-溴代琥珀酰亚胺各种氨基酸侧链的修饰剂4.酶蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。主链的切断修饰1）主链的切断引起酶活性中心的破坏，酶将丧失其活性。——主要用于探测酶活性中心的位置。2）主链切断后仍可维持酶活性中心的空间构象，酶的催化能力保持不变或损失不多，其抗原性等特性发生改变。——提高某些酶特性特别是药用酶的使用价值。3）主链切断有利于酶活性中心的形成，使酶分子显示其催化功能，使酶活力提高。——酶原——酶主链的切断修饰

4、胃蛋白酶原胃蛋白酶N端失去44个氨基酸残基HClpH1.5～2自身激活a、胃蛋白酶原的激活5.酶组成单位置换修饰氨基酸置换修饰：将蛋白酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法。核苷酸置换修饰：将核酸类酶核苷酸链上的某一个核苷酸换成另一个核苷酸的修饰方法。（1）酶分子组成单位修饰的作用通过修饰可以提高酶活力通过修饰可以增强酶的稳定性通过修饰可以使酶的专一性发生改变通过核苷酸置换修饰可获得各种人造核酸类酶。如：酪氨酸-RNA合成酶反应：催化酪氨酸与其对应的tRNA反应生成酪氨酰-tRNA置换：将51位的苏氨酸换为脯氨酸结果：酶对ATP的亲和性提高近

5、100倍，酶活力提高25倍。如：枯草杆菌的蛋白酶反应：催化蛋白质和多肽水解置换：活性中心上的丝氨酸换成半胱氨酸结果：酶对蛋白质和多肽的水解活性消失，出现催化硝基苯酯等底物进行水解反应的活性。采用核苷酸置换修饰技术将保守核苷酸以外的某个或某些核苷酸置换，就可以获得各种不同的人造核酸类酶。如：T4-溶菌酶置换：第3位的异亮氨酸换成半胱氨酸，半胱氨酸可与第97位的半胱氨酸形成二硫键。结果：酶活力保持不变，但酶对热的稳定性大大提高。氨基酸置换修饰的方法化学修饰法定点突变技术（2）定点突变技术在酶分子修饰中的应用定点突变（sitedirectedmutagenesi

6、s）：指DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变，从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程（proteinengineering）和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。定点突变技术用于酶分子修饰的主要过程（P148）1.设计新酶分子结构设计新酶的RNA的核苷酸排列次序或酶蛋白的氨基酸排列次序，确定需置换的核苷酸或氨基酸及其位置。2.确定突变基因碱基序列酶RNA→互补原则→DNA序列酶蛋白→遗传密码→mRNA→DNA3.获得突变基因寡核苷酸诱导的定位突变。4.获得新酶获得基因体外重组后导入宿主内进行表达。6.酶分子的物理修饰通过物理修饰，可以了解不同物理条

7、件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端pH值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。共价键与副键酶分子修饰的应用理论研究医学和工业应用酶的作用机制研究亲和标记法和差示标记法有机介质酶催化反应中的应用酶分子的修饰方法金属离子置换修饰大分子结合修饰侧链基团修饰肽链有限水解修饰氨基酸置换修饰酶分子的物理修饰氨基的修饰羧基的修饰巯基的修饰精氨酸胍基的修饰酪氨酸酚基的修饰组氨酸咪唑基的修饰色氨酸吲哚基的修饰分子内交联修饰4.6

8、酶的定向进化定向进化：模拟自然进化的过程，进行人工随机突变，并在特