磺胺类药物单链抗体的制备及其与磺胺噻唑相互作用研究.pdf

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1、第43卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第3期2015年3月ChineseJoumalofAnalyticalChemistry366—370DOI：10．11895／j．issn．02530820．140629磺胺类药物单链抗体的制备及其与磺胺噻唑相互作用研究李永翰温凯于雪芝李成龙王战辉(中国农业大学动物医学院，北京100193)(动物源食品安全检测技术北京市重点实验室，北京100193)摘要抗体与对应的小分子待测物之间的相互作用模式决定了免疫分析的特性。本研究以磺胺类药物杂交瘤细胞株4C7为起点，应用基因工程技术制备出单链抗体scFv4C7，采用间接竞争ELISA

2、法对比其与母本单克隆抗体的识别特性，同时采用同源建模构建scFv4C7的三维立体结构，并与磺胺噻唑(STZ)进行分子对接。间接竞争ELISA结果显示scFv4C7保留了亲本单克隆抗体的识别特性，分子对接结果显示STZ深陷入抗体的重链和轻链形成的“口袋”中，STZ分子更靠近重链，且主要与抗原互补决定区CDRH3相互作用。本研究为制备识别谱更广、亲和力更高的磺胺类药物抗体提供了必要的结构信息。关键词相互作用；同源建模；分子对接；单链抗体；磺胺噻唑1引言磺胺类药物(Sulfonamides，SAs)是目前应用范围最广、用量最大、种类最多的抗菌药物之一，其不合理使用在食品和环境中造成的

3、残留给人类健康带来潜在危害。基于抗原．抗体特异性反应的免疫分析具有灵敏度高、操作简便、成本低且适合现场快速检测而越来越受到重视。磺胺类药物多特异性抗体已有很多报道lj]。这些抗体识别磺胺类药物的种类存在显著差异，难以应用于磺胺类药物的多残留检测。研究磺胺类药物与抗体之间的识别机制，探讨影响抗体识别的关键因素，对磺胺类药物半抗原设计的进行改进从而制备出性能更加优良的抗体具有重要的理论意义和应用价值。单链抗体(Singlechainvariablefragment，scFv)是抗体分子中保留抗原结合部位的最小功能片段，以scFv为研究对象，通过同源建模、分子对接和构效关系等方法来研

4、究抗原一抗体之间的相互作用，可为了解抗体识别机制提供必要的结构信息3-6]。Wang等构建了河豚毒素的scFv，并通过同源建模和分子对接研究了scFv和河豚毒素的相互作用，预测相互作用的两个必需氨基酸为K183和I189，通过定点突变验证了该预测的可靠性[4]。He等利用基因工程技术将抗黄体酮scFv中的关键氨基酸W100定点突变成其它l5种氨基酸，发现突变体与野生型scFv的特异性和亲和力存在明显差异，其中，将WIO0突变成RIO0后显著提高了抗体对孕酮衍生物(Progesterone3．CMO)的亲和力J，证明可通过基因工程技术改变结合位点的关键氨基酸来改变抗体的识别能力，

5、并可能获得亲和力更高的抗体。本研究通过制备磺胺类药物单克隆抗体4C7对应的scFv，利用同源建模和分子对接，通过实验研究和理论分析对磺胺噻唑与4C7的相互作用进行了初步研究，为全面了解4C7的识别机制、制备识别谱更广的磺胺类药物抗体奠定了基础。2实验部分2．1仪器与试剂2720型PCR扩增仪(美国ABI公司)；HQ-60。lI型漩涡混合器(北京北方同正生物技术发展有限公司)：HDL．APPARATUS超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；Mini．PROTEAN4蛋白电泳设备(美国Bio—Rad公司)；GHP．9160A隔水式恒温培养箱(北京陆希科技有限公司)；H2C．2

6、50恒温振荡培养箱(苏州市培英实验设备有限公司)；ThermoScientificMuhiskanMK3酶标仪(美国ThermoFisherScientific公司)。2014~7-23收稿：2014．10—14接受本研究受国家自然科学基金面上项目(No．31372475)资助E—mail：wangzhanhui@cau．edu．cn第3期李永翰等：磺胺类药物单链抗体的制备及其与磺胺噻唑相互作用研究367磺胺类药物杂交瘤细胞株4C7和单克隆抗体Mab4C7由本实验室制备：pJB33载体由本实验室保存；RV308菌种来自于美国标准生物品收藏中心；QiagenRNeasyMinik

7、it、QIAshredder(Qiagen公司)；SuperScript～First—StrandSynthesisSystemforRT—PCR(Invitrogen公司)；异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、WizardDNAClean-upSystem(Promega公司)；限制性内切酶SfiI(美国NEB公司)；T4DNA连接酶、ExTaqDNA聚合酶、DL2000DNAMarker(TaKaRa公司)；HisTrapHP组氨酸标记亲和层析柱(GEHealthcare)；Amicon@U