阵列纸芯片比色法检测碱性磷酸酶.pdf

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1、第44卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第4期2016年4月ChineseJournalofAnalyticalChemistry591—596DOI：10．11895／j．issn．0253-3820．160140阵列纸芯片比色法检测碱性磷酸酶陈熙陈锦张慧妍汪付兵王方方吉邢虎“何治柯(生物医学分析化学教育部重点实验室，武汉大学化学与分子科学学院，武汉430072)(武汉大学中南医院检验科，武汉430071)摘要采用5-溴4．氯-3一吲哚磷酸盐(BCIP)／氯化硝基四氮唑蓝(NBT)显色体系，构建

2、了阵列纸芯片比色检测碱性磷酸酶(ALP)的方法。首先，借助烘干处理方式在光刻法制备的阵列纸芯片微孔中固定显色试剂，然后加入AIJP进行显色反应，最后，采用凝胶成像仪和普通照相机成像，读取显色强度(灰度值)进行比色检测。详细考察了显色条件对检测结果的影响，探讨了人血清白蛋白对ALP检测的增色效应，在最佳实验条件下，ALP检测的线性范围为1．5—20U／L，检出限(3o)为0．78U／L(=18)，比文献报道中纸芯片上检测ALP方法的检出限低约两个数量级。本方法成功用于实际血清样品检测，测定结果与临床值一致。在

3、此基础上，构建了双色阵列纸芯片，通过颜色的变化实现了ALP的可视化半定量检测。关键词阵列纸芯片；比色法；碱性磷酸酶1引言碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，ALP)是一种水解酶，可催化水解底物分子中的磷酸单酯，广泛存在于细菌、真菌及动物中⋯。血清中ALP水平是诊断肝癌、肝硬化、慢性肝炎等肝类疾病的指标，也是原发性肝癌的肿瘤标志物之一-2，3J。ALP也是酶联免疫吸附分析中常用的一种标记酶J。因此，建立一种快速、方便、廉价的碱性磷酸酶检测器件，具有重要的理论意义和实际应用价值。常规的ALP检测

4、方法包括显色法_5]、电化学法_6j、荧光法、化学发光法J、表面增强拉曼光谱法_9等。电化学法快速准确，但是难以用于复杂样品的分析，且需要外加电源；荧光法检测装置复杂，需要滤光片及外加光源等；化学发光检测线性范围宽，但缺乏稳定性；而使用拉曼光谱法需要专门的仪器，价格昂贵。纸芯片是近年来备受关注的一种具有广阔应用前景的微流控分析器件，具有价格低廉、可便携式、生物相容性好、高通量、简单快速、试剂消耗量小等优点u”。随着纸芯片制作方法的不断完善，基于纸芯片的分析检测方法也得到了不断发展l。其中，显色法直观、快速、

5、稳定，不需要附加光源、电能等复杂仪器设备，研究报道数量最多。目前，基于纸芯片的ALP显色检测方法也有相关报道。Li等借助BCIP(5-溴．‘4．氯-3-吲哚基-磷酸盐)／NBT(氯化硝基四氮唑蓝)显色体系开展了纸芯片上显色法检测ALP的可行性研究。Cheng等基于AIJP显色体系，构建了纸芯片ELISA检测新方法，实现了IgG和HIV．1病原蛋白的分析检测。Vella等L2将纸芯片用于肝脏疾病指示物的分析检测，借助纸芯片中滤膜的分离功能，实现了全血中天冬氨酸转氨酶、ALP以及总血清蛋白的分析检测。ALP的检

6、出限为15U／L，检测灵敏度有待进一步提高。本研究基于阵列纸芯片比色法检测ALP，通过优化显色反应条件，借助烘干处理方法降低背景信号以及人血清白蛋白增色效应等方式，提高了检测灵敏度。该方法用于实际血清样品的检测，检测结果与临床结果相一致。此外，借助双色阵列纸芯片开展了AIjP可视化半定量分析检测研究。2实验部分2．1仪器与试剂G．17光刻机(成都鑫南光机械设备有限公司)，PDC—M等离子体清洗器(成都铭恒科技发展有限公2016-02-25收稿；2016-03-07接受本文系国家自然科学基金(No．21205

7、089)，教育部高等学校博士学科点专项科研基金(No．20120141120036)资助项目+E—mail：xhu@whu．edu．cn592分析化学第44卷司)，KQ2200超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，PB一10酸度计(Sartorius)，KW-4H．350烤胶机(上海凯美特功能陶瓷技术有限公司)，HZQ—F160立式全温振荡培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)，凝胶成像系统(CHEMIDOCXRS，BIO—RAD)，COOLPIX5400尼康相机，Milli．QAdvantageA10超纯水

8、系统(美国Millipore公司)。牛小肠碱性磷酸酶(ALP，TaKaRa生物科技有限公司)，5一溴4．氯．3．吲哚磷酸盐(BCIP，TCI化成工业发展有限公司)，氯化硝基四氮唑蓝(NBT，北京经科宏达公司)，氯化镁、氯化钠和Tris购自Sigma公司。人血清白蛋白(HSA，Biosharp公司)，牛血清白蛋白(BSA，Roche文瀚科技)，葡萄糖氧化酶(GOD，Amresco公司)，辣根过氧化物酶(HRP，武汉