蛋白质结构与功能3ppt.ppt

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1、蛋白质的结构与功能StructureandFunctionofProtein(四)第四节蛋白质的理化性质一、蛋白质的理化性质二、蛋白质分离和纯化三、多肽链中氨基酸顺序分析——蛋白质一级结构的测定（一）两性解离和等电点及其分离纯化Pr是两性电解质。在溶液中的带电状况主要取决于溶液的pH值。PrCOOHNH3+PrCOO-NH3+PrCOO-NH2OH-H+OH-H+pH=pIpHpIpI定义：在某一pH值溶液中，Pr酸性基团和碱性基团的解离程度相当Pr分子所带正负电荷相等，净电荷为零此时溶液的pH值称为Pr的pI。Pr分子颗粒大小1-100nm之间,

2、属胶体颗粒范围，在溶液中能形成稳定的胶体。原因：（二）蛋白质的胶体性质表面形成水化层表面同种电荷的斥力除去这两个因素,Pr就会发生沉淀。由于胶体溶液中的Pr不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固吴宪教授1931年：“天然Pr分子借助次级键连接而成一种紧密，有规则的空间结构，变性作用使次级键破坏从而使结构松散”。1.蛋白质的变性(denaturation)定义：在某些理化因素的作用下，Pr严格的空间结构被破坏（不包括肽键的断裂），从而引起若干理化性质和生物学性质改变的现象。变性后的蛋白质称变性蛋白,能使Pr变性

3、的物质叫Pr变性剂。变性因素物理因素高温、高压紫外线、X射线、电离辐射和超声波等化学因素强酸、强碱有机溶剂、重金属盐高浓度尿素、盐酸胍等变性实质：破坏了空间结构，一级结构不受影响（分子组成、MW不变）。变性蛋白质的特点旋光性、光吸收改变等；①生物学活性丧失②理化性质改变③易被蛋白酶水解溶解度↓，沉降率↑，粘度↑，扩散速度↓，酶水解。变性与复性变性可逆变性：Pr变性后如将变性剂除去，该Pr分子的天然构象和生物学活性还能恢复。不可逆变性：若变性条件强烈，作用时间长，构像变化大，理化性质难以恢复。举例：医疗；生物制品保存；生活等。RNase的变性与复性变性后的蛋白质

4、由于疏水基团的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白质不一定都是变性后的蛋白质。加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为凝固。因此，凡凝固的蛋白质一定发生变性。总结：Pr变性、沉淀与凝固之间的关系变性Pr不一定沉淀沉淀Pr不一定变性变性Pr不一定凝固凝固的Pr一定变性2.沉淀与凝固定义：蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀。++++++++--------++++++++--------蛋白质胶体颗粒的沉淀带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质酸酸碱碱脱水脱水脱水不稳定的蛋白质颗粒（沉淀）带正电荷的蛋白质（疏水胶体）带负电荷的蛋白质（疏水胶体）碱酸（亲水胶体

5、）（亲水胶体）（亲水胶体）大部分蛋白质均含有带共轭双键的Tyr和Trp。这两种AA在280nm附近有特征性吸收峰。在此波长范围，Pr的OD280与其浓度成正比。利用这个性质，可以对蛋白质进行定量测定。（四）蛋白质的紫外吸收蛋白质浓度mg/ml＝1.45A280-0.74A260反应试剂颜色反应基团有此反应的Pr及AA双缩脲反应NaOH,稀CuSO4紫或粉2个以上肽键所有蛋白质Millon反应Millon,硝酸，亚硝酸红色酚基Tyr黄色反应HNO3及NH3黄、橘黄苯基Phe,Tyr乙醛酸反应乙醛酸H2SO4紫红吲哚Trp坂口反应次氯酸钠,萘酚红色胍基ArgFol

6、in酚试剂反应CuSO4磷钨酸-钼酸兰色酚基Tyr茚三酮反应茚三酮紫兰色游离氨、羧基Pro和羟Pro呈黄色（五）、蛋白质的呈色反应二、蛋白质分离和纯化研究Pr的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。1.Pr来源：微生物、动物或植物细胞；2.随时测定Pr活性并检测Pr含量;3.分离和纯化过程须在温和的条件下进行。分离方法沉淀法盐析法有机溶剂沉淀法层析法离子交换层析吸附层析凝胶过滤（分子筛）亲和层析……。电学法电泳法等电聚焦超速离心法纯度、Mw和pI测定层析法：凝胶过滤;高效液相色谱法电泳法：PAGE、梯度凝胶电泳、等电聚焦电泳等免疫化学法：专一的沉淀线S

7、DSPAGE电泳法：测定亚基数超速离心：成分均一其它：如,结晶法……定义：加入大量中性盐以破坏Pr的稳定因素并使从溶液中沉淀析出的现象。原理:破坏Pr两个稳定因素：水化膜和电荷层中性盐：(NH4)2SO4；Na2SO4；NaCl等。半饱和硫酸铵沉淀球Pr饱和硫酸铵沉淀清Pr优点：Pr不变性，常用。（一）盐析法（Saltingout)叫分段盐析法（二）电泳（electrophoresis)定义：带电粒子在电场中移动的现象称为电泳。Pr分子在溶液中可带净的负电荷或带净的正电荷，故可在电场中发生移动。不同的Pr分子所带电荷量不同，且分子大小也不同，故在电场中的泳动速

8、度也不同，由此可彼此分离。（见实验理论