登革热实验室检测.ppt

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1、登革热实验室诊断技术及评价病毒病预防控制所李建东内容概述检测指标及动态变化检测策略抗原检测病毒分离核酸检测抗体检测常用检测试剂比较登革病毒实验室检测指标重要免疫原诊断标记RT-PCRNS1：膜相关NS1，mNS1分泌型NS1，sNS1发病第1-9天出现病毒血症期必然出现的分子标识物可高达50µg/mLYYYYYYYYYYYY登革病毒首次感染7071421天IgM~90天IgA~45天IgG潜伏期病毒血症发热期急性期恢复期期病毒分离核酸检测NS1抗原检测IgM抗体检测病毒中和实验IgG抗体检测病毒中和实验PLoSNeglTropDis5(

2、9):e1309.登革病毒再次感染7071421天IgMIgAIgG潜伏期病毒血症发热期急性期恢复期期病毒分离核酸检测NS1抗原检测IgM、IgG&IgA检测病毒中和实验PLoSNeglTropDis5(9):e1309.病毒血症患者比例NS1抗原检出比例合适的时机采用合适的检测方法检测方法登革NS1抗原RT-PCR病毒分离登革IgM抗体登革IgG抗体发病天数1-6天1-5天1-5天5天以后3天以后确诊标准检出NS1抗原检出病毒核酸检出病毒检出IgM抗体，双份（间隔期不少于7天）IgM阳转或滴度血清4倍升高继发感染出现高水平IgG抗体（

3、捕获法）世界卫生组织登革防控指南2009登革实验室检测方法特点及费用世界卫生组织登革防控指南2009登革实验室检测方法优缺点世界卫生组织登革防控指南2009检测方法优势局限性登革病毒感染诊断核酸检测敏感特异；能分型早期诊断，利于救治污染造成假阳性较贵需要专业技术知识和仪器设备不能鉴别首次和再次感染病毒分离特异能分型需要专业技术知识和仪器设备耗时长不能鉴别首次和再次感染抗原检测易于操作可用于早期诊断敏感性略差血清学检测IgM检测，IgG阳转或4倍升高可用于急性感染确诊易于操作可鉴别首次和再次感染可引起漏诊,IgM抗体水平低,或在部分再次感

4、染的病例中检测不到需要2份样本病例确诊晚监测、暴发调查、干预措施评价IgM检测病毒分离和核酸检测鉴别可能的登革病例监测点实验室在病例筛查时易于操作确定病例血清分型可引起漏诊,IgM抗体水平低,或在部分再次感染的病例中检测不到只是用于急性期样本早期检测宜用PCR、NS1，发病5天后宜采用抗体检测KappacoefficientPCR=0.72NS1ELISA=0.81NS1Rapid=0.77不同检测方法的精确性NS1抗原检测3种商业化检测试剂盒PanBio（Inverness)-ELISA&LateralflowRapidtest（st

5、rip）Platelia（BioRad)-ELISA&LateralflowRapidtest（strip）SDBioline-Cassette万泰？？？阴性检测结果不能排除近期感染孕妇和携带类风湿因子的患者常可出现假阳性结果适用于多种标本临床标本急性期全血、血清或血浆，脑脊液（0-5天）4-8℃保存不超过2天长时间保存-70℃以下或干冰尸检组织标本应立即保存于-70℃以下或干冰疫情暴发地区的蚊虫媒介适用于所有血清型，首次感染更敏感尸检组织标本的NS1抗原检测PLoSNeglTropDis2011,5:e1147蚊媒标本中NS1抗原检测

6、Labinfectedmosquitoes:95.8%Fieldcaughtmosquitoes:PCR污染问题：敏感性增加，污染风险加大，套式PCR增加污染风险，实时定量RT-PCR污染风险降低，阴性对照为阴性不能排除污染的风险。防RNA酶内对照、定量分析特异性敏感性主要取决于引物、探针核酸检测流程图反应体系混合物正、反向引物混合物特异性荧光探针1)核酸分离2)Real-timePCR检测20µl5µl反应条件取决于病原体特异性PCR仪合适的PCR管病毒分离敏感性蚊虫蚊虫细胞（C6/36)哺乳动物细胞（Vero，BHK)乳鼠通常产生C

7、PE不同的细胞系往往有不同的指征病理表现6-10天4-8天4-8天需要多次传代工作量大，需要培养蚊虫细胞培养的设备与技术细胞培养的设备与技术耗时长、费用高适于登革病毒分离适于登革病毒分离可用于病毒分离不再推荐使用病毒分离的流程蚊媒匀浆或血清；加入细胞培养管或瓶；37℃吸附1小时，每15分钟轻轻摇动一次；补液；33℃孵育3-7天，每日或隔日观察CPE；IFA检测，传代，IFA检测。单抗检测分型。C6/36C6/36CPEC6/36CPEC6/36CPE病毒分离影响因素：标本采集、保存和运输，分离方法，病毒型别、载量，患者免疫反应等检测抗体

8、中和实验通过将血清与病毒混合，接种微量板内单层细胞，检测抗体对病毒感染性的影响。检出中和抗体可确定存在登革病毒保护性免疫。是唯一分型检测IgG抗体的方法。微量中和实验登革病毒首次与再感染特异性抗体动态变化检