质粒提取及酶切鉴定.ppt

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1、实验一质粒提取及酶切鉴定P158基因工程（geneticengineering）是指采用人工方法将不同来源的DNA进行重组，并将重组后的DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程。相关基础知识目的基因工具酶载体基因工程相关物质质粒存在于细菌细胞内、染色体外、共价闭合的小型环状DNA分子(covalentclosedcircularDNA)。具有自我复制功能。带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物经改造后具有多克隆位点。质粒(plasmid)特点能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状限制性核酸内切酶：------基因工程的

2、手术刀是分子生物学研究中的一种工具酶，能识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。如：EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列和切口是：EcoRⅠ：G↓AATTCHindⅢ：A↓AGCTT概念与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统（restriction-modificationsystem），限制外源DNA，保护自身DNA。作用分类酶结构、作用、识别及切割特异性的不同分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，基因工程技术中常用Ⅱ型Ⅰ型酶具有限制和DNA修饰作用，且识别及切割位点不同（下游100-1000bp）Ⅲ型酶具有限制和DNA修饰作用，识别及切割位点不

3、同（相距较近）（1）识别及切割位点相同（2）识别序列通常为4～8bp的回文结构；（3）切割可产生两类切口，三种末端。Ⅱ型限制酶特点Ⅱ型酶识别序列特点—回文结构(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口钝性末端粘性末端掌握质粒DNA提取的原理与方法了解DNA限制性核酸内切酶酶切鉴定原理质粒提取原理质粒的提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异：在碱性环境中，线性的大分子细

4、菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态；溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（Sodiumdodecylsulfate,SDS）可使细胞壁裂解。细菌经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。再经酒精沉淀、洗涤处理，可得到质粒DNA。由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。RelaxedcircleLinearizedformSuper-coiledform与DNA分子量标准物（Marker）比较能大概判断未知DNA的分子量质粒DNA为

5、环状，在酶切彻底的情况下，DNA片段数与酶切位点数目相同质粒DNA酶切鉴定的原理Marker质粒DNA过夜酶切操作步骤(Methods)分组：4人/组，每组提取两种质粒（空载及重组质粒）1.质粒的提取（1）接种一个单菌落（singlecolony）于5mL含相应抗生素的LB培养基中，37℃振荡培养至饱和状态（A600=0.4）或过夜。（教师准备）（2）取1.5mL离心管一支，加入1.4mL菌液，13000r/min离心1min去掉上清液。加入150μL的溶液Ⅰ，充分混悬细菌，在室温下放置10min。（3）加入200μL新配制的溶液Ⅱ。加盖，颠倒5次使

6、之混匀。冰上放置5min。（4）加150μL预冷的溶液Ⅲ，加盖后颠倒5次混匀，冰上放置15min。13000r/min离心5min，取400μL上清液移入另一离心管中。（5）向上清液中加入等体积苯酚/氯仿，震荡混匀，13000r/min离心2min，300μL上清液转移至新的离心管中。（6）向上清液中加入等体积无水乙醇，混匀，室温放置2min。离心5min，倒去上清乙醇溶液，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。（7）加入1mL70%乙醇，震荡并离心，13000r/min离心2min，倒去上清液，晾干，加入20μL的TE缓冲液，使DNA完全溶解，待用。2

7、.质粒DNA的酶切鉴定取一只1.5mLEP管加入以下试剂：酶切混合液：15μL质粒DNA：5μL混匀后，置37℃过夜保温，反应结束后4℃放置备用。