TaqMan-LNA探针荧光定量PCR快速检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒.pdf

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1、南方农业学报2011，42(12)：1545—1549JournalofSouthernA。gTiculturehttp：／／www．r血yxb．com传染性皮下及造血组织坏死病毒韦信贤1，一，童桂香1，谢宗升1，吴祥庆1，黄国秋·，黄玉柳1，廖永志1，黎小正卜(1广西渔业病害防治环境监测和质量检验中心，南宁530021；2上海海洋大学水产与生命学院，上海201306)摘要：【目的】建立快速、特异、灵敏检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的TaqMan—LNA探针荧光定量PCR方法，为IHHNV的临床诊断和疫情监测提供更简便的检测技术

2、。【方法】根据GenBank已发表的IHHNV毒株序列，在IHHNV保守区序列设计特异性引物和ITaqMan—LNA探针；对荧光定量PCR反应条件进行优化以缩短检测时间，提高特异性和灵敏度；应用TaqMan—LNA探针荧光定量PCR对广西地区的300份凡纳滨对虾样品进行检测，验证方法的实用性。【结果】TaqMan—LNA探针荧光定量PCR检钡

3、JIHHNV的灵敏度高，约为10个病毒粒子／反应，定量范围宽，在1．6x1011．6x10S拷贝／ixL的范围内具良好的线性关系；与SPF凡纳滨对虾组织、WSSV、副溶血弧菌的DNA和鸭v的RNA均无反应，特

4、异性好；组内变异系数为0．53％一1．75％，组间变异系数为0．81％一1．14％，重复性和重现性均较好，结果稳定可靠；临床应用结果表明，300份凡纳滨对虾样品检出193份阳性，阳性率为64．3％，表明广西沿海地区养殖的凡纳滨对虾IHHNV感染率较高。【结论】利用TaqMan—LNA探针建立检测IHHNV的荧光定量PCR方法具有快速、特异、灵敏、重复性好、能定量等优点，可用于对虾IHHNV的检测。关键词：凡纳滨对虾；传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)；TaqMan—LNA探针；荧光定量PCR中图分类号：$945．4文献标志码：A文章编号：2

5、095—1191(2011)12—1545—05RapiddetectionofinfectioushypodermalandhematopoieticnecrosisvirusinshrimpsusingTaqMan-LNAprobereal-timePCRWEIXin-xianl⋯，TONGGui-xiang1，XIEZong-sheng1，WUXiang—qing1，HUANGGuo-qiul，HUANGYu-liul，LIAOYong-zhil，LIXiao-zheng1+(1FisheriesDiseasePreventionEnviro

6、nmentalMonitoringandQualityTestingCenterofGuangxi，Nanning530021，China；2CollegeofFisheriesandLifeScience，ShanghaiOceanUniversity，Shanghai201306，China)Abstract：【0biectivelThepresentexperimentwasconductedtodevelopaTaqMan—LNAprobereal—timePCRassayfordetectionofinfectioushypodermal

7、andhematopoieticnecrosesvirusfIHHNV)toprovideconvenientdetectionteehnolo胛forclinicaldiagnosisandepidemicmonitoringofIHHNV．【Method】ThespecificprimersandTaqMan—LNAprobesweredesignedfromconservedIHHNVsequencesobtainedfromGenBank．Thereal—timePCRassaywasoptimizedtoreducethedetectio

8、ntimeandtoimprovethesensitivityandspecificity．ThreehundredclinicalshrimpsamplescollectedfromGuangxiwel'℃detectedbyreal—timePCRtoevaluatepracticalityofassay．【Result】Thereal—timePCRassayaccuratelydetectedandquantifiedIHHNV．Itshowedbetterlinearrelationshipfrom1．6x101to1．6x108copi

9、es／斗Landhadaminimumdetectionlimitofabout10virion．Themethodwas