实验二微量凯氏定氮法测定总氮量.ppt

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1、实验二总氮量的测定―凯氏定氮法一目的：学习凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理掌握蒸馏、滴定操作技术二、原理生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。甘氨酸的消化过程可表示如下：CH2NH2COOH+3H2SO42CO2+3SO2十4H2O十NH32NH3+H2SO4(NH4)2SO4蒸馏：浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量、

2、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的氢离子浓度降低，(NH4)2SO4+2NaOH2NH3+2H2O+Na2SO42NH3+4H3BO3(NH4)2B4O7+5H2O滴定：用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的摩尔数(相当于待测物中氨的摩尔数)计算出待测物中的总氮量。(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O(NH4)2SO4+4H3BO3本法适用于0.2~2.0mg的氮量测定。三、试剂1、浓硫酸2、粉末硫酸钾―硫酸铜混合物K2S04与CuS04.5H20以3：1配比研磨混合3、30％氢氧化钠溶液4、2％硼酸

3、溶液5、标准盐酸溶液(0.0098mol／L)6、混合指示剂(田氏指示剂)由50mL0．1％甲烯蓝乙醇溶液与200mL0．1％甲基红乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶中备用。酸性时为紫红色，碱性时为绿色。变色范围很窄且灵敏。7、样品—面粉1g五、操作方法1.样品处理固体样品:某一固体样品中的含氮量是用100g该物质(干重)中所含氮的g数来表示(％)。一般样品烘干的温度都采用105℃，因为非游离的水都不能在100℃以下烘干。在称量瓶中称一定量磨细的样品(如0.1g左右的干燥面粉)，然后置于105℃的烘箱内干燥4小时。用坩埚钳将称量瓶放人干燥器内，待降至室温后称

4、重，按上述操作继续烘干样品。每干燥1小时后，称重一次，直到两次称量数值不变，即达恒重。若样品为液体(如血清等)，可取一定体积样品直接消化测定。2、消化取凯氏烧瓶标号。各加几颗玻璃珠;在1及2号瓶中各加样品0.1g，催化剂(K2S04+CuS04.5H2O)200mg，浓硫酸5mL。在3及4号瓶中各加相同量的催化剂和浓硫酸，作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。每个瓶口放―漏斗，在通风橱内的电炉上消化。注意加样品时应直接送人瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上。消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适

5、当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止。定容：冷却后，加蒸馏水约10mL。(注意慢加，随加随摇)。然后将瓶中溶物倾入50或100mL的容量瓶中，并以蒸馏水洗烧瓶数次，将洗液并入容量瓶，用水稀释到刻度，混匀备用。蒸馏:改进型凯氏定氮仪结构特点：将蒸汽发生器、蒸馏器和冷凝器组成一个整体，体积小，安装容易，操作简便。(1)水蒸汽发生器和反应室(2)冷凝器和通气室(3)排水柱关键:搞清水管系统蒸馏器的洗涤１．接通冷凝水，先向蒸汽发生器中加入一定量的水(以排水口高度为宜)。２．水的自动喷出：将蒸馏水由加样室加入反应室，加样口水封，用酒精灯将其加热烧开将

6、酒精灯移开片刻，反应室内水自动喷出到蒸汽发生器打开蒸汽发生器出水口，放水。如此反复清洗3-5次。３．清洗后在冷凝管下端放一锥形瓶盛有5mL，2％硼酸溶液和1～2滴指示剂的混合液。打开冷凝水，进行蒸馏，如3-5min不变色则表明蒸馏装置内部已洗涤干净。3蒸馏过程：准备:取50mL锥形瓶3个，各加入5mL2％硼酸溶液和1―2滴指示剂，溶液呈淡紫色，用表面皿覆盖备用。打开冷凝水，置换成冷水。将一个盛有硼酸和指示剂溶液的锥形瓶放在冷凝器下，并使冷凝器下端浸没在液体内。加样:用移液管取5mL消化液（空白液和消化液分别做），细心地加入反应室，随后用小量筒加入30％

7、NaOH溶液5mL，关闭自由夹，在加样漏斗中加少量水做封口。蒸馏:关闭自由夹，打开冷凝水(注意不要过快过猛，以免水溢出,实验过程中，冷凝水可一直打开)。点燃酒精灯，蒸馏开始，当观察到锥形瓶中的溶液由淡紫色变绿时(约2―3分钟)，开始计时，蒸馏3分钟，移开锥形瓶，使冷凝器下端离开液面约1cm，同时用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外侧，继续蒸馏1分钟，取下锥形瓶，用表面皿覆盖瓶口。蒸馏完毕后，应立即清洗反应室，方法如前所述。如此3～5次。最后将自由夹同时打开，将蒸汽发生器内的全部废水换掉，继续下一次蒸馏。待样品和空白消化液均蒸馏完毕，同时进行滴定。4.滴定全部蒸馏

8、完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点。注意：使