琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段.ppt

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1、琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段中南民族大学药学院化学生物学教研室琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段1实验目的2实验原理3仪器与试剂4实验步骤5注意事项药学院化学生物学教研室1.实验目的学习用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度、浓度、构型及其相对分子质量大小的方法。药学院化学生物学教研室2.实验原理text1text2text3琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快捷，可以分辨用其他方法（如密度梯度离心法）无法分离的DNA片段。用低浓度的嵌入式荧光染料溴乙锭（EB）染色，在紫外光下可以检出1~10ng的DNA条带，从而可以确定D

2、NA片段在凝胶中的位置。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离1kb以下的小片段DNA效果较好，甚至可以分辨相差1bp的DNA片段。聚丙烯酰胺凝胶电泳速率快，容量相对较大，采用垂直装置进行电泳，但制备和操作比琼脂糖凝胶电泳困难，常用于核酸的序列测定。琼脂糖凝胶电泳的分辨率比聚丙烯酰胺凝胶电泳低，但其分离范围广，不同浓度的琼脂糖凝胶电泳可分离DNA片段的范围为200bp~50kb，通常在水平装置上进行，操作简便。药学院化学生物学教研室3.仪器与试剂（1）天平（2）电炉（3）制胶槽（4）电泳仪（5）电泳槽（6）荧光成像仪（7）移液枪仪器text2试剂（1）0.5×TBE电泳缓冲液：54

3、gTris、27.5g硼酸、3.72g二水合EDTA二钠盐，用水定容至1000mL。使用时稀释10倍。（2）EB溶液：称取EB溶于无菌水中，母液浓度1mg/mL，4℃避光保存。（3）相对分子质量标准（100bp，DNA标准物）（4）6×点样缓冲液（0.25%溴酚蓝，400g/L蔗糖）（5）琼脂糖（6）扩增好的毛囊DNA样品药学院化学生物学教研室4.实验步骤（5）电泳（4）点样（3）装配（2）制胶（1）溶解药学院化学生物学教研室4.实验步骤（1）称取0.4g琼脂糖于150mL三角瓶中，加入20mL0.5×TBE电泳溶液，置电炉上加热溶解（注意要经常晃动，避免过热溢出！

4、），制成2%琼脂糖溶液。琼脂糖药学院化学生物学教研室4.实验步骤（2）将琼脂糖溶液冷却至60℃左右，加入5μL浓度为1mg/mL的EB溶液（戴手套！），摇匀，立即小心倒入准备好的胶模槽中（已插好梳子），使琼脂糖溶液在槽中的厚度为3~5mm，排除梳齿上的气泡（一般轻轻抖动梳子或用小针头挑一下即可）。药学院化学生物学教研室4.实验步骤（3）室温下放置30~40min，使凝胶完全凝固后，加入少量0.5×TBE电泳缓冲液，小心拔出梳子，将胶膜放入电泳槽中（注意加样端接负极），加入适量0.5×TBE电泳缓冲液，使液面高出胶面约1mm药学院化学生物学教研室4.实验步骤（4）用移

5、液枪取10μLPCR扩增样品和2μL点样缓冲液混匀，用移液枪将样品加入凝胶的加样孔中，注意枪头不可穿透孔底。另取10μL相对分子质量标准液（已和加样缓冲液混匀），同法加样至另一泳道的加样孔。记录样品点样顺序（泳道）与点样量。药学院化学生物学教研室4.实验步骤（5）开启电源开关，接通电泳槽和电泳仪，注意DNA向正极移动，加样端要接负极。调节电泳电压为100V。在电泳途中可用紫外灯直接观察，DNA各条区带分开后，电泳结束。药学院化学生物学教研室5.注意事项（1）EB为强致癌物，注意避免接触皮肤，使用时一定要戴手套。（2）紫外光对眼睛有害，观察电泳结果时最好戴上防护镜或眼

6、镜，或隔着玻璃或有机玻璃观察。WARNING药学院化学生物学教研室6.思考题简述琼脂糖凝胶和EB染料在电泳分离DNA中的作用。药学院化学生物学教研室