细胞培养体外培养的基本方法和过程.ppt

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1、实验课时间：第7~9周实验课地点：104馆四楼注意事项：1.网上没有名字的同学请不要填报实验课名单。2.现在不能确定自己时间的同学不要填报，可以下次上课时再报。3.一旦填报就不能再更改时间。体外培养的基本原理与技术一、从体内生存环境到体外生长条件二、体外培养的基本方法和过程三、体外培养物的生长生物学四、细胞分离与纯化五、细胞系（株）、细胞克隆六、培养物的观察检测方法二、体外培养的基本方法和过程植块（explant）：从动物体内取出，用于培养的小块组织一般称为外植块或简称植块。分离（散）细胞［isolated（diss

2、ociated）cell］：由组织块分散后制成的单个细胞一般称之～。细胞悬液（cellsuspension）：单个细胞分散存在于培养液或者其它平衡盐溶液、缓冲溶液中，就称之～。几个名词和概念：当培养物的总体积不断扩大，培养过程持续到一定的时候，原先的培养器皿已不能满足培养物的空间要求，这时就需要将培养物分成若干小的部分，继续培养。因此，按照培养过程中培养物是否需要被分割后再培养，而将体外培养分为原代培养或称初代培养（primaryculture）和继代培养（secondaryculture)或称再培养（subcult

3、ure）两大类。二、体外培养的基本方法和过程几个名词和概念：（二）继代培养（三）体外培养的基本方法和技术（四）培养物的冻存与复苏（五）培养物的污染（一）原代培养二、体外培养的基本方法和过程（一）原代培养（primaryculture）二、体外培养的基本方法和过程原代培养，通俗地讲，就是第一次培养。它是指将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过程。原代培养的概念包含以下几方面含义：①原代培养的实质就是初次培养，即培养物一经接种到培养器皿中就不再分割，任其生长繁殖而不更换培养物的生长器皿；②原代培养

4、中的“代”并不是指细胞的“代”数，原代培养物中的细胞在接种之后并不一定没有分裂增殖。相反，在原代培养过程中，培养物中的细胞也可能经历多次的细胞分裂活动而产生多个子代细胞；③原代培养过程中不分割培养物不等于不更换培养液，也不等于不更换培养器皿，像盖玻片培养法和悬滴培养法，即便在换液过程中更换培养器皿，但不更换培养组织细胞所附着的生长基质盖片，仍属于原代培养；④植块培养不一定都是原代培养，植块培养有时候在培养物增长到一定程度后，也需要分割培养物为较小的部分再培养。二、体外培养的基本方法和过程（一）原代培养（primary

5、culture）１、取材及培养材料的制备２、分离（散）细胞的方法３、接种与培养过程４、更换培养液二、体外培养的基本方法和过程（一）原代培养（primaryculture）（1）准备工作：（2）制备基本步骤（技术路线）：主要是取材器具、用品的灭菌以及实验者、实验动物的清洁与消毒。１、取材及培养材料的制备：二、体外培养的基本方法和过程（一）原代培养（primaryculture）大块组织洗去血污剔除多余成分切成约1mm3大小的植块植块培养将所取组织剪碎蛋白酶溶液消化机械方法吹打组织块不锈钢网筛过滤过滤液离心用培养液悬浮成

6、细胞悬液计数并调节细胞密度培养分离的细胞二、体外培养的基本方法和过程（2）基本步骤（技术路线）：（一）原代培养（primaryculture）１、取材及培养材料的制备：二、体外培养的基本方法和过程关于取材：（1)取材要准确：取材是体外培养工作的开端。如果在这最初的实验过程中没有取到合格、理想的实验材料，整个体外培养过程就很难达到预期的目的。(2)关于取材及制备培养材料的步骤：就动物不同组织的取材而言，取材的步骤大同小异。但在具体操作过程中，还需要根据具体的实验情况做一些调整。（一）原代培养（primarycultur

7、e）１、取材及培养材料的制备２、分离（散）细胞的方法３、接种与培养过程４、更换培养液二、体外培养的基本方法和过程（一）原代培养（primaryculture）（1）机械解离细胞法：1）吸管吹打法--2）过筛法--（2）酶学解离细胞法：1）胰蛋白酶离解细胞法--2）胶原酶离解细胞法--（3）螯合剂解离细胞法：常用螯合剂：乙二胺四乙酸钠（EDTA-Na）、柠檬酸钠、枸橼酸钠。二、体外培养的基本方法和过程２、分离（散）细胞的方法：（一）原代培养（primaryculture）１、取材及培养材料的制备２、分离（散）细胞的方法

8、３、接种与培养过程４、更换培养液二、体外培养的基本方法和过程（一）原代培养（primaryculture）３、接种与培养过程二、体外培养的基本方法和过程接种（seeding）也称种植(plating)或体外移植(explantation),实际上就是将取材并切割好的组织块（植块）或者分离好的细胞悬液加到培养器皿内的过程。如果将准备好的植块（包括