单克隆抗体制备技术.doc

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1、单克隆抗体制备技术单克隆抗体制备标准化操作方案(McAb-sop) 第一章: 小鼠免疫 第二章: 细胞融合 第三章: 细胞建株 第四章: 细胞株鉴定 第五章: 腹水制备 第六章: 抗体纯化和鉴定(略) 第一章.                     小鼠免疫(BALB/c)  小鼠免疫是单抗制备的关键一环,质控小鼠免疫是制备优质单抗的唯一保证。一.小鼠免疫分两程方案:根据免疫学原理小鼠免疫方案设计如下:1.短程免疫方案:  第一次:  1d  100ug(可溶性Ag)+等体积完全佐剂.  腹腔注射.0.4ml/只  

2、第二次:  7d  100ug+等体积不完全佐剂          腹腔注射.0.4ml/只  第三次:  12d  50ug                                IV  0.3ml/只(强化)第四次:15d  20ug                                IV  0.3ml/只    第17d~24d内融合    2长程免疫方案:  第一次:  1d   100ug+等体积完全佐剂          腹腔注射(IP)0.4ml/只  第二次: 14d   100ug

3、+等体积不完全佐剂          IP     0.4ml/只  第三次: 21d   100ug                           IP或IV0.4ml/只                        第四次: 25d    50ug                             IV   0.3ml/只(强化)第五次:28d   20ug                             IV   0.3ml/只 第30d~37d内融合. 注意:a.在融合前(即加强免疫前)必

4、须测定免疫鼠血清滴度,短程免疫滴度必须≥1:8000,长程免疫≥1:32000,方可做融合.b.免疫周期完成后所有小鼠需在一周内做完融合.否则不能保证融合质量。                                                                            二．小鼠免疫质控标准1．免疫鼠血清滴度  短程≥1：8000，长程≥1：32000；                   2．小鼠免疫后需在一周内做完融合；3．免疫鼠脾脏明显大于空白鼠脾脏并且较粘连。免疫鼠选择：

5、免疫种类为:balb/c小鼠；性别.雌性佳；大小：6-7周龄：体重：20g;健壮.活泼。 第二章．细胞融合一． 融合前准备1． 脾细胞：取符合免疫质控标准的鼠在无菌条件下取出其脾脏，并制成单个脾细胞悬液，每只鼠的脾细胞约1～3亿。在制备过程中严格保证无菌。制备脾细胞可选择研磨器+筛网或用无菌注射器吹吸。2． SP2/0细胞准备：SP2/0细胞在融合前4天复苏.并用8-Ag筛选两次，隔天换液，在融合前一天换成普通培养基1640,10%小牛血清，SP2/0细胞数量在2000万～3500万为宜，细胞处于分裂期较佳，衰老细胞不

6、宜使用。3． PEG1450准备：取PEG1450干粉高压后加入等体积PBS在60℃溶解即可使用，一次融合取0.8ml50%PEG1450.4． HAT培养基准备：根据铺板数量准备，20%小牛血清的HAT1640培养基.20ml/块板。5． 终止液15-20ml:不含Hepes的1640培养基或PBS(PH7.4)二.融合:制备脾细胞悬液并用PBS(PH9.4)洗涤干净后混入SP2/0细胞按脾细胞比SP2/0=10:1～5:2混合并离心,1200rpm×５min离心后滴干混合细胞.轻敲弹松细胞团块。在37℃水浴中加入P

7、EG1450 0.8ml在50秒内加完　不宜吹打，加完后在37℃水浴中反应2min后加入终止液在5min内加完15～20ml,加终止液时应沿管壁缓慢加入.动作应轻柔.不宜吹打以免使刚融合的细胞分离。三.融合后加样:融合细胞终止后于900rpm×8min离心，并吸干以防残留PEG。离心后把融合细胞转入HAT培养基，并滴板200ul/孔，全过程应防止吹散融合细胞。四.换液:待融合细胞在HAT中培养7天左右后(即未融合的SP2/0和脾细胞死后)换成HT培养基。200ul/孔第8～10天检测。第三章．细胞建株 一.融合板检测：

8、      待融合板换液细胞长至中等大小约1万个细胞以上开始检测(检测方法参见附表ELISA方法)在ELISA质控合格(即阴性对照<1.0，阳性对照>1.0)后挑选阳性孔(一般OD450≥0.5)作亚克隆。 二.亚克隆方法及检测:     挑出融合板阳性孔全部细胞加入8-10mlHT培养基，混均铺板4-6纵行；待亚克隆生长5-7天