溶菌酶的制备及其性质.doc

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1、实验七溶菌酶的制备及其性质【实验目的】同羧肽酶实验【实验要求】同羧肽酶实验【实验内容】1.溶菌酶Y活性检测⑴酶活力测定方法⑵酶活力单位定义⑶比活力定义⑷蛋白含量测定方法2.蛋清溶菌酶的提取⑴每组4～5个新鲜鸡蛋⑵利用等电点沉淀及树脂层析等方法进行溶菌酶提取3.溶菌酶的分离、纯化⑴利用各种方法，从上述提取液分离⑵每步纯化前蛋白纯度检测⑶分离纯化过程中跟踪检测活性组份的蛋白质含量和酶活性4.溶菌酶理化性质⑴溶菌酶的分子量测定⑵溶菌酶的等电点测定5.溶菌酶的酶学性质⑴在活力单位定义确定后，求出溶菌酶的Vmax和Km⑵初步确定溶菌酶的最适pH

2、⑶初步确定溶菌酶的最适温度⑷提出最少两种溶菌酶的可逆抑制剂并验证抑制类型⑸提出溶菌酶的激活性并验证(6>溶菌酶的热稳定性【实验原理】9/9溶菌酶

3、0.8左右，最适温度为50OC，最适PH为6～7左右。在280nm的消光系数[]为13.0。该酶活性可被一些金属离子Cu2+、Fe2+、Zn2+<10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+、Ca2+<10-5～10-3M）、NaCl所激活。b5E2RGbCAP　　溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋(含量约为2%～4%>和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源，目前，溶菌酶仍属于紧销的生化物质，广泛应用于医学临床，具有抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等多种药理作用。p1EanqFDPw溶菌酶常温下在中性盐溶液中具

4、有较高天然活性，在中性条件下溶菌酶带正电荷，因此在分离制备时，先后采用等电点法，D152型树脂柱层析法除杂蛋白，再经SephadexG-50层析柱进一步纯化。最后用SDS-PAGE鉴定为一条带。采用福林酚法测蛋白含量，分光光度法测定酶活性。DXDiTa9E3d【实验材料】1.实验器材循环水式真空泵HSB-IⅡ。蛋白紫外检测仪。记录仪。紫外分光光度计。梯度混合器(500mL>。721型光分光光度计。冰冻离心机；冰箱；透析袋；酸度计；部分收集器；恒流泵；圆盘电泳装置；恒温水浴锅；层析柱(2.6×50cm>(1.6×30cm>；布氏漏斗(5

5、00mL>；吸滤瓶(1000mL>；G-3砂芯漏斗(500mL>RTCrpUDGiT2．实验试剂⑴鸡蛋清<鲜鸡蛋） ⑵底物微球菌粉⑶D152大孔弱酸性阳离子交换树脂 ⑷固体氯化钠2SO4；固体磷酸氢二钠溶菌酶标准品；SephadexG50⑺N-乙酰葡萄糖胺；硫酸铜；硫酸亚铁；硫酸锌；氯化镁；氯化钙；氢氧化钠；盐酸⑻SDS聚

6、丙烯酰胺凝胶电泳试剂<见实验六）；蛋白含量测定<福林法）试剂<见实验二）⑼聚乙二醇-20000、两性电解质【实验操作】1.蛋清的制备将4～5个新鲜的鸡蛋两端各敲一个小洞，使蛋清流出<鸡蛋清pH值不得小于8），轻轻搅拌5分钟，使鸡蛋清的稠度均匀，用两层纱布过滤除去脐带块，量体积约为100ml.jLBHrnAILg2.鸡蛋清粗分离按过滤好的蛋清量边缓慢搅拌边加入等体积的去离子水，均匀后在不断搅拌下用1mol/LHCl调pH值至7左右，用脱脂棉过滤收滤液。xHAQX74J0X3.D152大孔弱酸性阳离子交换树脂层析⑴D152树脂处理：将D1

7、52树脂先用蒸馏水洗去杂物，滤出，用1mol/LNaOH搅拌浸泡并搅拌4～8小时，抽滤干NaOH,用蒸馏水洗至近pH7.5,抽滤干,再用1mol/LHCl按上述方法处理树脂，直到全部转变成氢型，抽滤干HCl,用蒸馏水洗致近pH5.5，保持过夜，如果pH之不低于5.0，抽滤干HCl,用2mol/LNaOH处理树脂使之转变为钠型，pH值不小于6.5。吸干溶液，加pH6.50.02mol/L的磷酸盐缓冲液平衡树脂。LDAYtRyKfE⑵装柱：取直径1.6cm，长度为30cm的层析柱，自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液，关闭层柱出口，待树脂沉降

8、后，放出过量的溶液，再加入一些树脂，至树脂沉积至15～20cm高度即可。于柱子顶部继续加入pH6.5,0.02mol/L磷酸盐缓冲液平衡树脂，使流出液pH为6.5为止，关闭柱子出口，保持液面高出树脂表面1cm左右。Zzz