16srrna基因测序技术的比较

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1、WhitePaper®微生物鉴定：AxiomMicrobiomeArray技术与16SrRNA基因测序技术的比较摘要过去十多年来，大规模并行的高通量、短读长16S核糖体RNA（rRNA）基因测序已经取代了传统的长读长Sanger测序，用于群落中细菌的鉴定。1这种基于新一代的靶向扩增子方法的转变，为微生物样品的分析提供了一种更高效、更经济的方法；然而，这种方法是以牺牲分类分辨率为代价的，仅限于通过保守的16SrRNA基因引物来检测细菌，而这些细菌与微生物群落中的其他成员（如真菌、病毒和原生动物）是没有同源性的。尽管全基因组的宏

2、基因组测序等其他方法也被用于分析微生物群落，但这些方法需要更高的Reads深度，才能准确地推断分类的起源，就每个样品而言成本太高。在此，我们提出一种新颖的微生物分析方法，它基于Affymetrix的Axiom®基因分型平台，可在单个反应中实现对一个样品里所有生物体――包括细菌、病毒、原生动物、真菌和古细菌的检测，分辨率达到菌种甚至常常达到菌株水平。我们认为，Axiom®MicrobiomeArray可实现更高的准确性和分辨率，并采用了简化的操作流程和简单的分析软件。结果Axiom®MicrobiomeArray是为分析生物界

3、或生物域中的微生物个体而设计的。Axiom®MicrobiomeArray利用Axiom®2.0assay的技术，其中包括全基因组等温扩增（WGA）的步骤。从微生物中提取出的DNA作为起始材料，直接用于流程的第一步。为了获得由RNA组成的病毒基因组的子集数据，提取出的RNA被逆转录，而产生的cDNA可作为Axiom®assay流程的模板。Axiom®MicrobiomeArray的数据是通过一个名为AxiomMicrobialDetectionAnalysisSoftware（MiDAS）的软件界面来分析的。这个软件利用La

4、wrenceLivermore国家实验室开发的CompositeLikelihoodMaximization（CLiMax）算法。2,3AxiomMiDAS针对芯片上也存在的非基因组，非目标探针的信号、在非目标探针的第99百分位的探针强度设立阈值，将探针水平的杂交强度转化成双态模型（开/关）。算法随后利用这一信息来建立样品的预测模型，以便最佳地解释探针水平的数据。这种迭代的“Greedy”算法过程将目标加入样品的描述中，最终以所检测生物体的列表为结束。之后执行按经验确定的过滤参数，基于条件对数似然值除以初始对数似然值的比值，

5、进一步细化初始的检测目标列表。建议使用0.2的阈值，以便去除对预测模型贡献最小的目标。AxiomMiDAS在下面所述的研究中产生结果，都使用了这一最终的阈值。与16S和18SrRNAPCR方法特异针对细菌或真菌不同，全基因组扩增（WGA）步骤并非特异性扩增微生物的目标DNA。因此，样品中存在的宿主基因组DNA（gDNA）将与微生物DNA一起扩增，因为不存在微生物特异的富集。为了评估Axiom®MicrobiomeArray的检测极限（LOD），我们选择了三种细菌基因组，作为Axiom®2.0assay目标制备的起始样本，同时

6、起始量在1至100万个基因组当量（图1）。我们选择的细菌基因组代表了不同的科，覆盖各种基因组大小和GC含量（蜡样芽胞杆菌：5.4Mb，35%GC；海栖热袍菌：1.9Mb，46%GC；伯克氏菌Burkholderiathailandensis：6.7Mb，67%GC），以控制任何可能对Axiom®2.0assay技术产生影响的因素。检测的灵敏度是在一系列人类gDNA的背景浓度下评估的，因为微生物检测应用可能包括来从人体不同部位采集的检样，这可能有各种宿主DNA背景信息。4图1：Axiom®MicrobiomeArray的检测极

7、限（LOD）。对于图中所示的每个细菌基因组DNA（gDNA），1至100万个拷贝被作为Axiom®2.0assay目标制备的起始样品，其中存在或不存在指定量的HapMap人类gDNA（NA18501）。“+”表示利用AxiomMiDAS检测到起始细菌gDNA。“-”表示利用AxiomMiDAS未检测到起始细菌gDNA。这些LOD实验所用的微生物gDNA购自ATCC。将冻干的DNA重悬在低EDTA的TE缓冲液中（10mMTrisUltrapure，0.1mMEDTA，pH8.0），并利用Quant-iTPicoGreen®ds

8、DNAAssayKit（ThermoFisherScientific）确定浓度。为了计算每个基因组当量所需的质量，将染色体DNA的质量加入一个质粒拷贝的重量中。作为背景的人类gDNA样品是HapMapNA18501（CoriellInstituteforMedicalResearch）。结