扫描电镜与透射电镜样品制作(完全版).doc

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1、相关仪器的信息： 透射电镜：JEOL(公司)JEM-1230（型号）TEM，产地：日本 超薄切片机：Reichert-JungUltracutEultramicrotome，产地：奥地利扫描电镜：PhilipsXL30ESEM，产地：捷克 临界点干燥仪：HitachiHCP-2Criticalpointdryer，产地：日本 真空喷镀仪：Eiko IB5 ioncoater，产地：日本 包埋剂：SPI-CHEMSpurrresin，产地：USATEM样品包埋块制作有关注意事项一、取材：1、动作迅速：组织离体后，应将其快速放入固定液中，使组织细胞尽可能保持原来的生活状态；2、减少损伤：选择

2、锋利切割器械，减少牵拉或挤压组织；3、组织块大小：一般要小于1mm3。二、固定：固定是指用化学固定剂或一些物理方法迅速杀死细胞的过程，目的是尽可能保持细胞的原有生活状态，不发生位移，减少组织结构变化。固定剂的主要作用是使蛋白质、脂质等生物大分子发生某种交联。1、用固定液固定的样品若漂浮在溶液表面，应通过抽真空的方法让样品沉入溶液中2、使用锇酸的注意事项９I通风橱中的锇酸溶液为2%的储备液，使用之前需用0.2MPBS或二甲砷酸盐缓冲液稀释成1%的锇酸溶液。II锇酸为剧毒、极易挥发的试剂，必须在通风橱中操作，废液必须收集在密闭容器中。第一次使用锇酸的同学，请务必获得老师或其它熟悉操作人员的指

3、导。三、漂洗：应彻底漂洗干净，减少固定液与固定液或与脱水剂之间的反应。四、脱水：脱水是将组织中的游离水彻底清除的过程。由于常用的包埋剂大都是非水溶性树脂，只有将生物组织中的游离水清除干净，包埋剂才能浸入组织。脱水过程中应注意：I逐级脱水而不能急剧脱水；II更换溶液时动作要快，特别是不要让组织离开溶液，否则会在组织内外产生气泡；III脱水过程中若要长时间停留或过夜，应放在70%脱水剂中，并在4℃保存。五、渗透：渗透就是用包埋剂逐渐取代组织中的脱水剂，使细胞内外空隙被包埋剂所填充。包埋剂通常由树脂、硬化剂、增塑剂及催化剂4种试剂按一定比例配制而成。包埋剂配制及使用过程中的注意事项：I所有容器

4、及玻璃棒等应是清洁和干燥的；II配制过程中应搅拌均匀，使用过程中应避免异物，特别是水、乙醇、丙酮等混入包埋剂；９III配制好的包埋剂应密封保存，避免受潮。剩余包埋剂可密封并储存在-10—-20℃冰箱中，延长其使用期。９表1戊二醛溶液的配制终浓度1.01.52.02.53.04.05.00.2MPBS/ml5050505050505025%戊二醛水溶液/ml46810121620重蒸水加至/ml100100100100100100100表20.2M磷酸缓冲液（PBS）的配制A液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液B液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液Na2HPO428.4g或Na2HPO4.H2

5、O31.61g或Na2HPO4.2H2O35.6g或Na2HPO4.7H2O53.63g或Na2HPO4.12H2O71.64g加双蒸水至1000mLNaH2PO424.0g或NaH2PO4.H2O27.6g或NaH2PO4.2H2O31.21g加双蒸水至1000mL按下表比例混合A、B液后，配成0.2mol/L的母液，其中pH7.0为常用配方pH值5.86.06.26.46.66.87.07.27.47.67.88.0A液8.012.318.526.537.549.061.072.081.087.091.594.7B液92.087.781.673.562.551.039.028.019

6、.013.08.505.30在缓冲液中加入葡萄糖，蔗糖或氯化钠等均能改变渗透压。表3多聚甲醛-戊二醛固定液的配制溶液名称剂量10%多聚甲醛溶液20ml0.2MPBS或二砷酸盐缓冲液50ml25%戊二醛水溶液10ml重蒸水20ml表42%锇酸溶液的配制试剂用量锇酸/g1重蒸水/ml50９表5Spurr包埋剂配方药品名称硬配方软配方我们现用的配方VCD树脂10g10g10gDER7366g7g8gNSA26g26g26gDMAE0.4g0.4g0.4g注：通过改变DER736的用量可以调节包埋剂的硬度。DMAE的用量则调节聚合反应的速度。９透射电镜样品制备程序：No.1包埋切片样品的制作过程

7、样品在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜，然后按下列步骤处理样品：²倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；²用1%的锇酸溶液固定样品1-2h；²倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；²用梯度浓度（包括50%，70%，80%，90%和95%五种浓度）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇处理一次，每次20min；最后过度到纯丙